Sp1和Sp3介导的转录调控

基本转录因子Sp1和Sp3对转录调控区GC盒有很强的亲和力,参与几乎所有细胞功能,包括细胞增殖、凋亡、分化和新生物的转化.但在同一细胞中Sp1和Sp3对不同基因的作用并不相同,二者对基因特异性的转录调控是Sp1和Sp3研究领域的重要问题.近年来发现,Sp1和Sp3自身表达水平、结合的靶序列、磷酸化、糖基化等翻译后修饰,其他蛋白质的结合以及染色质结构与修饰等方面均可影响Sp1和Sp3的转录活性.本文从Sp1和Sp3蛋白参与转录调节的机制以及影响其基因特异性转录活性的诸方面因素这两大侧面,介绍了近年来的最新进展.     

ERα与Sp1相互作用激活LRP16启动子转录活性

根据已报道的LRP1 6启动子序列 (2 6kb) ,采用PCR反应获得 6个启动子 5′删除突变体 ,分别插入pGL3 Basic载体 ,构建 6种 5′缺失报告基因表达载体 (pS1 ～pS6) .分别与ERα真核表达载体共转染MCF 7细胞 .用双荧光素酶报告系统测定荧光素酶活性 ,以明确LRP1 6基因上游启动子区域中的雌激素反应序列 .结果显示 ,pS1 ～pS6均有雌二醇反应性 .进而对pS5的 3′端缺失分析发现LRP1 6基因翻译起始位点上游 - 2 1 4至 - 2 5 1位置的序列具有雌激素应答 ,序列分析发现该片段序列中包含了一个供转录因子Sp1结合的GC富含位点和一个ERα反应元件的半位点 (1 2ERE Sp1 ) ,进一步突变分析显示这两个元件均为雌激素反应性所必需 .以含这两个顺式元件的序列 (- 2 5 3bp至 - 2 2 4bp)作为探针 ,超级迁移凝胶电泳试验结果表明了ERα和Sp1蛋白均可以和探针结合 .研究发现了雌激素上调LRP1 6基因表达的一个增强子元件— 1 2ERE Sp1 ,ERα和Sp1蛋白需要与DNA结合形成复合体 ,通过其相互作用激活转录     

抑瘤基因NGX6启动子的克隆与功能鉴定

NGX6是一个结直肠癌候选抑瘤基因,其转录调控机制不明．采用生物信息学技术预测其启动子区,并构建NGX6启动子荧光素酶报告基因重组体pGL3/Enhancer/1126．荧光素酶活性检测结果表明该区域具有强启动子活性．应用PromoterInspector program,FistEF,CpGplot和MatInspector Professional软件分析发现,NGX6基因转录调控区为一个不含TATA盒,而含有CAAT盒的GC富集区．凝胶迁移阻滞实验确定NGX6基因启动子区域具有Sp1特异性结合位点,Sp1特异性阻断剂光神霉素(mithramycin A)能明显抑制NGX6启动子的活性和NGX6基因的表达;封闭内源性Sp1能下调NGX6基因mRNA表达水平．     

三氟拉嗪通过诱导p16INK4a抑制BGC-823细胞增殖

为探索三氟拉嗪（trifluoperazine, TFP）抗肿瘤作用机制,对胃癌BGC-823细胞进 行TFP（5、10 μmol/L）处理后,利用计数法、BrdU脉冲标记法、Western印迹等方法从细胞形态、细胞增殖、S期细胞百分比以及相关因子表达水平等方面进行分析. 结果显示,TFP处理后,细胞形态发生明显改变,细胞增殖受到明显抑制且呈时间计量 效应关系;S期细胞比例下降;p16INK4a表达水平升高.为进一步研究TFP诱导 p16INK4a表达的分子机制,本实验采用插入p16INK4a启动子片段及荧光素酶报告系统 的载体pGL3-Basic-p16INK4a（-967~-165 bp）,研究了TFP在转录水平对p16INK4a启 动子活性的影响.结果表明, TFP能够提高p16INK4a的启动子活性.上述结果提示,TFP 通过诱导p16INK4a表达抑制BGC-823细胞增殖.     

人LOXL2启动子的鉴定与初步分析

LOXL2（lysyl oxidase like 2）是赖氨酰氧化酶（LOX）家族的一个重要成员,不仅可促进细胞外基质中胶原蛋白和弹性蛋白的交联,而且在转录调控、细胞信号转导以及细胞粘附等生物学过程中也有重要作用。多篇研究表明,LOXL2在多种肿瘤中高表达,且与多种肿瘤细胞的增殖迁移等生物学行为密切相关。LOXL2的表达调控机制目前仍不清楚。为了进一步研究LOXL2的转录调控机制,本研究克隆鉴定了LOXL2的启动子。首先通过数据库对LOXL2基因结构及潜在启动子区域进行了分析,进而以人的基因组DNA为模板,通过PCR定向克隆策略,构建了5个长度不同并覆盖LOXL2基因转录起始位点附近约1.7 kb的LOXL2基因启动子荧光素酶报告基因重组体。启动子活性分析结果表明,与对照组相比,5个重组体均具有启动子活性(P<0.05),提示LOXL2基因核心启动子定位于转录起始位点附近约185 bp的区域内。转录因子结合位点分析结果表明,LOXL2基因启动子缺乏典型的TATA盒,但含有GC盒以及Sp1、NFkB等潜在的转录因子结合位点。外源转染Sp1表达质粒能显著增强LOXL2基因启动子的活性（P<0.05）,提示Sp1能直接激活LOXL2的转录。     

槲皮素对前列腺癌细胞增殖及转录因子Sp1功能的抑制作用

雄激素受体(androgenreceptor,AR)作为核转录因子,其高表达、基因突变以及AR辅激活因子的过表达等造成AR的异常激活与前列腺癌细胞的增殖、恶化转移、多药耐药等密切相关.天然黄酮槲皮素(quercetin),是一很有潜力的预防和治疗前列腺肿瘤的化合物.槲皮素不仅抑制前列腺癌细胞LNCaP的增殖,并呈剂量依赖性,而且下调前列腺癌中AR的表达、抑制AR的转录激活功能.GCbox是AR核心启动子的主要正调控元件,是转录因子Sp1的结合位点.细胞转染结果表明,槲皮素能抑制Sp1蛋白对AR启动子的激活作用,可能是槲皮素下调AR表达的机理之一.进一步研究显示,槲皮素还能明显抑制Sp1蛋白对AR转录激活功能的增强作用.Western印迹结果显示,槲皮素对Sp1蛋白表达无明显影响,但能够诱导c-Jun的高表达,而高表达的c-Jun蛋白能逆转Sp1蛋白对AR的转录激活作用,由此推测,槲皮素可能通过介导c-Jun与Sp1的蛋白质相互作用,抑制Sp1的功能,进而起到抑制AR表达和功能的作用.免疫沉淀结果又进一步证实了Sp1与c-Jun二者的相互作用.因此,槲皮素可能通过抑制前列腺癌细胞中AR的表达和功能抑制了细胞的增殖,其分子机理可能与槲皮素诱导的c-Jun与Sp1蛋白相互作用、降低Sp1对AR的转录激活作用有关.     

p53过表达抑制同源盒基因NKX3.1启动子活性

NKX3.1是前列腺特异表达的同源盒基因,在前列腺癌的发生发展中起重要作用,而在前列腺癌进展中常会发生p53的基因突变.为研究两者之间的关系,构建NKX-3.1启动子(1 040bp)-荧光素酶报告基因重组质粒（pGL3-1040）及其缺失突变体,瞬时转染前列腺癌细胞LNCaP.通过荧光素酶表达活性分析,检测p53过表达对NKX3.1启动子活性的影响.结果表明：p53在LNCaP细胞中过表达可明显抑制NKX3.1启动子活性;RT-PCR及Western印迹检测p53过表达对NKX3.1表达的影响.结果表明,p53过表达可以明显抑制同源盒基因NKX3.1的表达.通过TRANSFAC软件分析,在NKX3.1基因上游-526至-507区存在一个p53反应元件的5′核心序列.缺失pGL3-1040中的p53反应元件核心序列并不能消除p53对NKX3.1启动子的抑制作用,表明p53不是通过p53反应元件直接抑制NKX3.1启动子活性.进一步通过5′缺失突变分析,发现NKX3.1启动子-140～+8 bp区仍受p53负调控.此148 bp区域中含有一个Sp1和一个CREB元件,瞬时共转染Sp1表达载体或CREB表达载体的结果表明,p53并不是通过与Sp1或CREB相互作用对NKX3.1启动子发挥抑制作用的.上述结果表明,p53过表达可以抑制同源盒基因NKX3.1启动子活性,下调NKX3.1基因的转录,其调控机制有待进一步研究.     

ING1家族各异构体抑制HeLa细胞增殖的分子机制研究

ING1(inhibitor of growth 1)是一个候选抑癌基因家族,p47ING1a、p33ING1b和p24ING1c是其三种剪接异构体.通过MTT法和流式细胞术研究ING1a、ING1b和ING1c对HeLa细胞增殖的影响,结果发现三者均可将HeLa细胞阻滞于G0/G1期并抑制细胞生长.采用PCR方法构建ING1a和ING1b的PHD结构域缺失体1aΔC和1bΔC,进而使ING1a,ING1b、ING1c、1aΔC和1bΔC在HeLa细胞中过表达.采用Western blot检测上述HeLa细胞中p16INK4a、PTEN/p27Kip1和p53/p21Waf1的表达变化,结果发现ING1a、ING1b、ING1c和1aΔC均可促进p16INK4a的表达,其中ING1c的促进作用最为显著,1bΔC则略微抑制了p16INK4a的蛋白质表达.利用荧光素酶分析初步确定1aΔC可增强p16INK4a启动子活性而促进p16INK4a的转录,1bΔC则抑制了p16INK4a启动子活性.上述结果阐释了ING1家族各成员对HeLa细胞增殖的影响及其分子机制,从而确定了各异构体功能的异同及它们所调控的重要基因.首次发现除p53/p21Waf1通路外,ING1家族各异构体还可通过上调p16INK4a和PTEN的表达而抑制肿瘤细胞生长,并且ING1a的PHD结构域删除体可以增强p16INK4a的转录,这为研究ING1家族抑制肿瘤细胞生长的分子机制提供了新的线索.     

p16INK4a基因的功能及其调控

p16INK4a蛋白能抑制CDK4和CDK6的活性,使pRb处于非磷酸化或低磷酸化状态而能与转录因子E2Fs结合,从而抑制DNA 的合成,阻止细胞由G1期进入S期.p16INK4a的表达受Ets1和Ets2的正调控,受Bmi-1的负调控.p16INK4a基因缺失、突变、甲基化、RNA剪接加工错误可导致细胞周期失控和癌变.应用p16INK4a对某些肿瘤进行基因治疗的研究正在进行中.     

人NFBD1启动子的鉴定与初步分析

NFBD1,也称MDC1,是一个参与细胞内DNA损伤后细胞应答反应的重要分子.为了进一步深入研究其转录调控机制,本研究克隆鉴定了NFBD1的启动子.首先应用5′ RACE技术鉴定了NFBD1的转录起始位点,首次发现NFBD1至少存在3种丰度和转录起始位点不同的转录变异体.然后,通过PCR定向克隆和酶切亚克隆策略,构建了覆盖NFBD1基因5′侧翼区起始密码子ATG上游5 kb区域的一系列NFBD1启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,NFBD1启动子区域定位于主要转录起始位点区域附近1.5 kb的区域内.采用转录因子结合位点预测分析软件分析表明,NFBD1启动子缺乏TATA盒,但含有典型的CCAAT盒和GC盒以及其它潜在的转录因子结合位点,提示Sp1和NF-Y等转录因子可能参与NFBD1的转录调控