稻草生物质的预处理及其发酵产酶与酶解效果研究

采用稀酸、稀碱、高温稀碱、亚硫酸盐法(SPORL法)和稀酸-亚硫酸盐法(稀酸SPORL法)对粉碎稻草秸秆预处理,考察不同预处理方法对稻草基质多菌发酵产纤维素酶的影响,分析预处理前后稻草基质主要成分的变化,酶水解液中糖组分的含量。结果表明:稀酸SPORL法处理的稻草粉在固态发酵产酶和酶解糖化都具有较好的效果,所得羧甲基纤维素酶(CMCase酶)和β-葡萄糖苷酶(β-G)比酶活分别达到21 511.22和51 508.41 U/g,同时酶水解率达到84.99%。除SPORL法外,其他预处理方式所得酶活均出现了不同程度的下降。稀酸预处理对稻草基质中的半纤维素去除效果较好,含量由20.77%下降到7.34%;稀碱高温处理对木质素脱除效果较好,Klason木质素含量由12.47%下降到7.58%。通过酶解糖化实验发现,未处理稻草粉酶水解率仅为17.82%,稀碱高温法效果最好,稻酶水解率达到91.66%。稀酸和稀酸SPORL法处理后,稻草粉基质的酶解糖化液中,戊聚糖占总糖相对含量较低,分别为7.38%和6.92%。     

乙酸分级预处理甘蔗渣对纤维素酶解性能的影响

为提高甘蔗渣的纤维素酶解性能,采用乙酸脱木素结合碱脱乙酰基的预处理工艺 (Acetoline工艺) 对甘蔗渣进行预处理,考察了乙酸脱木素过程中若干因素对预处理结果的影响,并对预处理后甘蔗渣的纤维素酶解性能进行了研究。结果表明,经过Acetoline预处理后甘蔗渣在7.5％固体含量、15 FPU+10 CBU/g固体的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶用量下酶解48 h,酶解聚糖转化率接近80％。与稀酸预处理相比,Acetoline预处理可以得到更高的酶解聚糖转化率。实验结果表明Acetoline工艺是一种可有效提高甘蔗渣纤维素酶解性能的预处理方法。     

pH值对绿色木霉(Trichoderma viride)产纤维素酶的影响

采用微晶纤维素为唯一诱导性碳源,对绿色木霉(Trichoderma viride)在摇瓶发酵过程中控制与不控制pH产纤维素酶进行比较.控制pH时胞外蛋白浓度为0.72 mg/mL比不控制pH时提高43%;FPA、EG、GB和CBH酶活为15.0U/mL,120.0U/mL,1.75U/mL,0.85U/mL分别是不控制pH时的2.1、2.3、11.7和1.7倍.在不同pH下测定纤维素酶液各酶活,表明pH值显著影响纤维素酶各单酶酶活.在pH2.7时,β-葡萄糖苷酶酶活仅为pH4.8时酶活的4%;pH回调试验结果表明β-葡萄糖苷酶对pH敏感,并在催化功能上发生不可逆变化.对纤维素酶液添加分离得到的各单酶,当添加β-葡萄糖苷酶时最多可以提高FPA酶活20%.因此β-葡萄糖苷酶是影响综合酶活的关键酶.通过拉曼光谱检测出β-葡萄糖苷酶在pH5.0有活性状态下,酶蛋白主链结构主要为a-螺旋和无规则卷曲;在pH2.0没有活性状态下,酶蛋白主链结构的无规则卷曲发生较大变化,a-螺旋也受到一定影响.这说明pH对β-葡萄糖苷酶构象的改变是造成其活性变化的主要原因.     

康宁木霉QF-02纤维素酶酶学性质的研究

对康宁木霉QF-02生产的纤维素酶的一般酶学性质进行了研究。该纤维素酶系中滤纸酶、羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶、β-葡萄糖苷酶的最适作用温度分别为55℃、65℃、50℃和70℃,最适作用pH为4.0-5.0;在40-50℃范围内热稳定性较好,24 h保温后的残留酶活在48.5%以上;在pH3.0-8.0范围内比较稳定,4℃保存24h后的残留酶活在75.7%以上。与几种商品纤维素酶相比,该纤维素酶对未处理和碱预处理稻草都表现出较强的糖化能力。     

碱与微波联合处理蔗渣对里氏木霉发酵产纤维素酶的影响

以蔗渣为原料,采用碱和微波辐射联合处理后用于里氏木霉纤维素酶的液态发酵。采用单因素试验与正交试验确定了最佳的处理条件为:0.30 mol/L的NaOH溶液浸泡,微波功率160 W,处理5 min。在此条件下得到的单位能耗的酶活净增值最高。后续发酵结束后,酶活较未经处理的蔗渣发酵后所得酶活有显著提高。其中,β-葡萄糖苷酶活、滤纸酶(FPase)活、羧甲基纤维素酶(CMCase)活分别提高了81.3%,88.2%,154.5%。     

粗糙脉孢菌丝氨酸/苏氨酸激酶家族基因敲除库纤维素酶表达分泌研究

【目的】蛋白磷酸化在丝状真菌细胞对外界纤维素酶诱导信号感应以及信号胞内的传导过程中有着重要的作用,而蛋白磷酸化是由蛋白激酶来完成的。为了挖掘在丝状真菌纤维素酶表达过程中发挥重要作用的激酶基因,对粗糙脉孢菌丝氨酸/苏氨酸家族的61株蛋白激酶单基因突变体的纤维素酶表达分泌情况进行了分析测定。【方法】在以微晶纤维素为唯一碳源的条件下,7株单基因突变体胞外分泌蛋白产量有显著变化,随后,对这7株突变体胞外蛋白进行了详细的SDS-PAGE分析和内切-β-1,4-葡聚糖酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活、外切纤维素酶酶活以及木聚糖酶酶活的测定。【结果】突变株W14、W38、W87和W40胞外分泌蛋白含量提高了30%以上,除了突变株W14外,其它突变体的内切-β-1,4-葡聚糖酶酶活分别显著提高了62%、42%和42%。而突变株W85、W26和W46胞外分泌蛋白含量降低了50%以上,相对应的内切-β-1,4-葡聚糖酶酶活也分别下降了86%、75%和84%。【结论】这些关于粗糙脉孢菌丝氨酸/苏氨酸家族蛋白激酶基因的挖掘,为进一步深入研究蛋白激酶在纤维素酶诱导表达调控中的分子机理奠定了基础。     

大连医科大学基因工程研究所、＇机能实验室，大连116027 β-葡萄糖苷酶在工农医领域的应用

β-葡萄糖苷酶能够水解多种β-葡萄糖苷。它与其他纤维素酶共同作用,可以将自然界中含量丰富的纤维素水解成人类可以直接利用的能源物质——葡萄糖;β-葡萄糖苷酶在医学上也有重要的应用,它可用于一些肿瘤疾病的诊断和治疗。人缺乏β-葡萄糖苷酶,可以引起葡萄糖苷-N-脂酰鞘氨醇在巨噬细胞溶酶体内积累,引发戈谢病(Gaucherdisease)。     

β-葡萄糖苷酶在工农医领域的应用

β-葡萄糖苷酶能够水解多种β-葡萄糖苷.它与其他纤维素酶共同作用,可以将自然界中含量丰富的纤维素水解成人类可以直接利用的能源物质--葡萄糖;β-葡萄糖苷酶在医学上也有重要的应用,它可用于一些肿瘤疾病的诊断和治疗.人缺乏β-葡萄糖苷酶,可以引起葡萄糖苷-N-脂酰鞘氨醇在巨噬细胞溶酶体内积累,引发戈谢病(Gaucher disease).     

β-葡萄糖苷酶Bgl747的定向筛选、重组表达与酶学性质

【背景】β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,EC3.2.1.21)是3种纤维素酶中的重要成分之一。目前工业用纤维素酶大都来源于木霉等真菌,较少来源于细菌,而且在应用中还存在反应条件(温度、pH等)适用范围窄、酶活力较低、获取成本偏高等问题,这大大限制了β-葡萄糖苷酶的应用。从秸秆还田土壤细菌中筛选β-葡萄糖苷酶有极大地可能性筛选出酶学性质较好的酶,从而解决现存的工业问题。【目的】从土壤中筛选β-葡萄糖苷酶,通过基因重组、表达优化和蛋白纯化获得一株新型β-葡萄糖苷酶,探究其酶学性质,为其在工业上的应用奠定基础。【方法】利用功能筛选法从土壤中筛选出β-葡萄糖苷酶,全长为747 bp,命名为Bgl747,构建重组表达质粒pET-28a-Bgl747,以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌株,经IPTG诱导实现可溶性表达并优化表达条件,通过His标签蛋白纯化试剂盒纯化获得纯化酶,探究其酶学性质。【结果】β-葡萄糖苷酶Bgl747属于BglB超家族,分子量为27.23 kD,最适反应温度为45°C,最适p H 4.0;最佳诱导条件:当OD600为1.0,加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG,于37°C、220 r/min诱导10 h后β-葡萄糖苷酶Bgl747蛋白获得最高表达量1.82 mg/m L;底物为对硝基苯-β-D-半乳糖苷(p-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside,p NPG)时的比酶活225.07 U/mg,米氏常数Km值和最大反应速率Vmax分别为0.268mmol/L、547.23μmol/(L·min);1mmol/LK+、1 mmol/L和10 mmol/L Fe2+、30%甲醇、30%乙醇、1 mmol/L和10 mmol/L盐酸胍对酶活都有促进作用,30%TritonX-100及10 mmol/L SDS抑制其酶活效果较为明显;该酶受到产物葡萄糖的反馈抑制,葡萄糖浓度越高,抑制效果越明显,但当葡萄糖浓度为1 mol/L时,酶活仍保持50%以上。【结论】Bgl747反应温度范围较广且稳定,酶学性质优异,为其在纤维素降解等工业应用奠定基础。     

间歇出酶对纸浆产纤维素酶的促进作用

为了提高分批补料制备纤维素酶的生产能力,本研究采用间歇出酶的方法,定期将部分酶蛋白从培养液中分离出来,以达到高效产酶的目的。在以里氏木霉为产酶菌、以纸浆为碳源的分批补料产酶过程中,从第4天开始间歇出酶。当每天取出10.0%~20.0%的酶液时,总滤纸酶活和总β-葡萄糖苷酶活分别提高26.3%~40.3%和69.8%~108.9%。为避免感染杂菌,菌丝体也可以不回收;当每天取出15.0%的酶液和菌丝体时,总滤纸酶活提高42.9%,总β-葡萄糖苷酶活提高84.3%,菌丝体质量浓度维持在4~5 g/L。结果表明:只要菌丝体浓度维持在合理范围内,间歇出酶可以保护已产出的酶蛋白,降低培养液中的产物浓度,从而大幅度提高产酶能力。     

玉米秸秆酶水解过程中的酶复配条件优化

降低酶解成本是纤维素乙醇生产的关键。利用酶复配技术优化蒸汽爆破处理后玉米秸秆的酶水解工艺条件,以提高纤维素的转化率。通过单因素实验和正交实验,研究了纤维素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶对酶解效率的影响规律。结果表明,汽爆玉米秸秆,纤维素含量达42.21%,半纤维素仅为3.65%。纤维素酶对酶解过程起决定性作用,添加40 FPU/g时,酶解率为75.45%;木聚糖酶可促使更多的纤维素暴露出来,添加1 500 IU/g时,酶解率最高为78.03%;β-葡萄糖苷酶有助于消除纤维二糖积累造成的反馈抑制,用量40 IU/g时,纤维二糖浓度为0.330 4 g/100 m L,酶解率达76.45%。正交实验确定最佳工艺为:纤维素酶用量30 FPU/g,木聚糖酶用量800 IU/g,β-葡萄糖苷酶用量40 IU/g;该条件下,进行底物质量浓度25%的验证实验,葡萄糖达9.3g/100 m L,若用单一天冠纤维素酶,葡萄糖仅5.9 g/100 m L,提高了57.63%。三种酶的影响顺序为:纤维素酶木聚糖酶β-葡萄糖苷酶。     

Acremonium纤维素酶在玉米芯糖化中的应用

玉米芯作为一种木质纤维素类农业废弃物,同时也是生产生物乙醇的潜在原料。在玉米芯糖化过程中,纤维素酶的作用是十分关键的。本研究比较了里氏木霉纤维素酶、绿色木霉纤维素酶和Acremonium纤维素酶各相关酶活。其中Acremonium纤维素酶的滤纸酶活约是里氏木霉纤维素酶的6倍,是绿色木霉纤维素酶的8倍。其羧甲基纤维素酶活和绿色木霉纤维素酶基本相等。Acremonium纤维素酶的β-葡萄糖苷酶酶活是里氏木霉纤维素酶的38倍,以及绿色木霉纤维素酶的41倍。而Acremonium纤维素酶的木聚糖酶活只相当于绿色木霉纤维素酶的70%。这说明Acremonium纤维素酶降解纤维素的能力可能强于另两种纤维素酶,而降解半纤维素类物质的能力要弱于绿色木霉纤维素酶。在玉米芯糖化实验中,使用Acremonium纤维素酶的糖化液中产生的最高葡萄糖浓度比里氏木霉纤维素酶的高14%,比绿色木霉纤维素酶的高58%。Acremonium纤维素酶用量在10 FPU/g时,反应16 h就基本可以达到最佳效果,而另两种酶用量则需达到30 FPU/g,反应48h才能达到最佳效果。使用Acremonium纤维素酶的糖化液中产生的最高木糖浓度与里氏木霉纤维素酶相等,比绿色木霉纤维素酶低42%。而同时使用Acremonium纤维素酶及绿色木霉纤维素酶时,其糖化液中最高木糖浓度有所提高,比绿色木霉纤维素酶的高31%。Acremonium纤维素酶可以有效地应用于玉米芯糖化,为玉米芯的资源化提供一种可能的方案。     

不同溶剂分级提取的茶多糖的组成及降血糖活性

比较绿茶中不同溶剂分级提取的茶多糖的得率、含量、单糖组成及降血糖活性的差异,以从茶叶中分离出高活性的茶多糖.粗老绿茶采用去离子水低温提取茶叶中的水溶性多糖TPSⅠ,水不溶性多糖先用草酸铵提取其果胶类多糖TPSⅡ,再用碱提取,所得到碱提取液回调至pH中性后可溶解部分为碱溶性多糖TPSⅢ,并分析其得率、含量、采用气相色谱和离子色谱分析了其单糖组成,通过四氧嘧啶腹腔注射造成高血糖模型,连续灌胃茶多糖12 d,对比研究两种茶多糖的降血糖活性.并比较复合纤维素酶提取与去离子水提取在得率、含量、单糖组成及其降血糖活性的差异.TPSⅠ单糖组成以鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸为主;TPSⅡ以半乳糖和半乳糖醛酸为主;TPSⅢ以阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖为主.降血糖活性顺序为:TPSⅠ＞TPSⅢ＞TPSⅡ,但TPSⅠ得率最低.复合纤维素酶提取的多糖得率、糖醛酸提取率比热水提取的多糖高1.53倍和1.42倍.酶提茶多糖较水提茶多糖降血糖效果更明显些.表明茶叶中水溶性多糖降血糖活性最好,复合纤维素酶提取可以提高其得率,增强其活性.     

定点突变技术提高β-葡萄糖苷酶活性

β-葡萄糖苷酶(Bgl)是纤维素水解过程中的限速关键酶。提高Bgl的酶活,对于增强纤维素酶水解力有着十分重要的作用。本研究根据3D同源模建及分子对接,预测分析活性中心,利用定点突变做出针对性的改造。对来源于米曲霉的β-葡萄糖苷酶基因进行六个位点的定点突变,并将其在大肠杆菌中进行了突变基因的高效表达。经IPTG诱导后,分离纯化并进行酶学性质分析,获得酶活力提高的两个突变位点(Asn~(347)Ser,Gly~(235)Met),结果表明N~(347)S和G~(235)M位点的突变使酶的比活力显著提高,比原始酶活分别提高了43.1%和14.7%。这一研究为进一步提高β-葡萄糖苷酶活性研究提供一定的理论依据。     

酶解法提取纯化虎杖提取物中自藜芦醇的工艺研究

本文对虎杖提取物中虎杖苷的酶解条件及苷元白藜芦醇的提取纯化工艺进行研究,以样品中自藜芦醇的含量为指标,对纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、复合酶进行筛选,结果表明以复合酶的水解效率最高:采用正交实验对影响复合酶酶解的因素:加酶量、温度、酶解时间进行考察;并对酶解后提取物中自藜芦醇的提取纯化工艺进行研究.得出如下较理想的酶解条件和提取纯化工艺:虎杖提取物,加水(pH 5)10倍,加20%的复合酶,于50℃保温24 h;酶解后的提取物经水、乙醇-水、碱溶液分步溶解沉淀,得白藜芦醇粗品,含量可达65%,工艺稳定可行.     

黄翅大白蚁来源β-葡萄糖苷酶的分子改造

纤维素水解成为葡萄糖需要一系列纤维素酶的作用,其中β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases)起着至关重要的作用。来自于培菌白蚁中肠的β-葡萄糖苷酶(MbmgBG1)具有较高的葡萄糖耐受性(1.5 mol/L的葡萄糖,保持60%以上的酶活力),但是,酶活力低和热稳定性差限制了β-葡萄糖苷酶(MbmgBG1)在食品以及工业领域中的应用。因此通过对保守氨基酸附近的非保守氨基酸定点突变,获得点突变体(F167L、T176C、E347I、R354K、N393G和V425M),其中突变体F167L、R354K的比活力(底物pNPG)比MbmgBG1分别高出约2倍和4倍。突变体的K_(cat)/K_m值比野生型大,反映了突变体对底物的亲和力以及催化能力比MbmgBG1强。当酶活力保留60%以上时,MbmgBG1所耐受的葡萄糖浓度为1.5 mol/L,而F167L为2.0 mol/L,R354K为3.0 mol/L。这些特性的增强表明,对活性中心附近保守区域内的非保守氨基酸突变,可以较大程度地影响活性,因此需要更深入地研究β-葡萄糖苷酶的活性中心位点,进行改造以提高催化效率。     

β-葡萄糖苷酶产生菌的分离筛选

从土样中分离筛选到3株β-葡萄糖苷酶产生菌,其中As.n.XD-1酶活力最高,pNPG酶活为19.67U,纤维二糖酶活为31.47U。该β-葡萄糖苷酶在pH4-6及4-60℃之间较稳定;4℃存放60d酶活仍可保留90.6％。粗酶液中还含有α-葡萄糖苷酶（0.02U）、淀粉酶（1.13U）、纤维素酶（0.16U）和CMC酶（1.18U）。     

斜卧青霉去泛素化蛋白酶CREB的缺失提高纤维素酶的生产

斜卧青霉Penicillium decumbens T.是1种重要的产纤维素酶丝状真菌,能有效地降解利用木质纤维素生产第2代生物燃料。为了提高斜卧青霉纤维素酶的产量,构建了去泛素化酶基因creB的敲除盒,并通过同源双交换重组的方法,获得了creB基因缺失突变株ΔcreB。该突变株呈现明显的纤维素酶表达分泌抗葡萄糖代谢阻遏效应,ΔcreB菌株的滤纸酶活、内切纤维素酶活、木聚糖酶活以及外切纤维素酶活分别提高1.8倍、1.71倍、2.06倍以及2.04倍,其胞外蛋白质含量提高了2.68倍。确定了creB基因缺失突变株具有抗碳源代谢物阻遏的生理现象,CREB对斜卧青霉生产纤维素酶的能力具有显著影响,为系统改造丝状真菌高产纤维素酶菌株提供了理论指导。     

生物炭-牛粪堆肥中产β-葡聚糖苷酶微生物群落应答碳代谢抑制效应

【背景】在高浓度葡萄糖引起的碳代谢抑制效应下,产β-葡聚糖苷酶(β-glucosidase)功能微生物群落为适应碳代谢压力的变化,会差异化表达糖耐受和非糖耐受的功能基因。在堆肥中添加生物炭可以改变微生物生存的环境,进而影响微生物群落的组成与功能。【目的】分析在不同碳代谢压力下添加生物炭对产β-葡聚糖苷酶功能微生物群落的结构组成与功能的影响。【方法】在生物炭牛粪-稻草堆肥中添加葡萄糖、纤维二糖及β-葡聚糖苷酶抑制剂,构建不同的碳代谢压力。以细菌来源GH1家族的β-葡聚糖苷酶基因为分子标记基因构建基因克隆文库。同时测定羧甲基纤维素酶酶活和β-葡聚糖苷酶酶活。【结果】放线菌、变形菌和拟杆菌是功能微生物群落中的优势菌群。其中,CL处理组变形菌数量有所下降,在添加了抑制剂的处理组中,拟杆菌的数量明显上升。高浓度葡萄糖显著抑制了羧甲基纤维素酶酶活,但对β-葡聚糖苷酶酶活影响不大,其中低浓度纤维二糖的处理可以显著诱导β-葡聚糖苷酶活性。GHCH处理组中β-葡聚糖苷酶表现出高浓度葡萄糖激活特性。【结论】添加生物炭未明显影响参与纤维素降解的功能微生物群落对碳代谢抑制效应的应答。与自然堆肥相比,在添加了生...     

纤维素酶在生物质转化中的应用研究进展

纤维素酶是木质纤维素转化的重要酶系,主要是由内切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组成,水解不同位置的糖苷键从而形成葡萄糖。本文总结了纤维素酶近几年来的研究开发与应用研究进展,包含产酶菌和菌种选育、辅助蛋白,介绍了纤维素酶来源和组成、纤维素酶工业化生产的最新研究进展以及纤维素酶在生物质转化方面的应用,纤维素酶在1.5代、2代纤维素燃料乙醇及生物质制气中都有重要的应用。