牛视网膜微血管内皮细胞体外分离与培养的实验研究

目的:探讨牛视网膜微血管内皮细胞(bovine retinal capillary endothelial cells,BREcs)体外分离、培养方法,为研究视网膜血管性疾病提供一定的实验基础。方法:无菌条件下取出视网膜并剪碎,经筛网过滤、胶原酶消化获取视网膜微血管内皮细胞,接种于明胶包被的培养瓶中,原代培养时用不同的培养基筛选细胞,并在传代时利用差速黏附法以获得较纯BRECs,通过形态学观察和免疫组化方法鉴定BRECs。结果:用此法原代培养BRECs纯度达98%,混有的血细胞及神经组织细胞碎片在换液和传代过程中逐渐被去除,成纤维细胞和周细胞的污染可分别用不同的培养基和差速黏附法纯化去除。结论:该方法简单有效,获得的BRECs纯度高,生长状态良好,为研究眼部血管性疾病提供良好平台。     

原代SD大鼠视网膜微血管内皮细胞的培养及鉴定

目的 探讨大鼠视网膜微血管内皮细胞的体外分离培养方法.方法 选取6～8周龄SD大鼠5只,摘取眼球,挤压球壁后,人工剥离视网膜.将大鼠视网膜剪碎,依次经过200μm、75μm不锈钢筛网;收集滤液,离心,弃上清,予0.1％II型胶原酶消化15～20min;再次将消化液通过45μm尼龙筛网,反复冲洗筛网,收集网上物;添加培养...     

树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株的建立及鉴定

目的 建立树鼩视网膜来源的微血管内皮细胞的体外分离培养技术以及永生化细胞株,为体外利用树鼩视网膜微血管内皮细胞开展相关研究提供新的实验材料。方法 利用Ⅱ型胶原酶、分散酶和DNaseⅠ酶消化法分离培养出原代视网膜微血管内皮细胞,利用差速消化法纯化内皮细胞,然后利用携带SV40T基因的慢病毒转染细胞,再挑取单克隆后进行传代培养。对传至50代以上的细胞进行形态学观察、免疫荧光鉴定以及核型鉴定。结果 采用混合酶消化法能够分离获得微血管内皮细胞,纯化后的细胞呈不规则多角形和梭形。经慢病毒转染后的细胞传代培养后细胞形态一致,到第50代时细胞形态结构仍较好。细胞免疫荧光结果显示标志性蛋白VWF、CD34、Claudin1、ZO-1和永生化SV40T表达阳性。生长曲线结果显示：细胞生长旺盛,第2～4天时处于对数生长期,第4天进入平台期。细胞核型结果显示：染色体数与树鼩染色体相同,即所获取的细胞为永生化的树鼩视网膜微血管内皮细胞。结论 成功建立的树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株具有较好的形态结构与功能,为视网膜病变及眼科相关疾病的研究提供了新的实验材料。     

视网膜微血管内皮细胞在糖尿病视网膜病变中的研究现状

糖尿病视网膜疾病是导致成年人失明的主要因素,是糖尿病的一种令人恐惧的并发症,高血糖被认为是促进其发展的主要原因。高血糖不断地破坏视网膜的微血管系统最终导致视网膜的许多代谢,结构和功能的紊乱。视网膜微血管内皮细胞在微脉管系统中形成树枝状供应视网膜神经,这些内皮细胞的解剖和生理符合重要视觉保护的营养需求[1]。一方面,内皮组织务必确保氧的供应和代谢活跃的视网膜营养供应;另一方面,内皮细胞有助于血-视网膜屏障将循环产生的毒素分子,白细胞促炎性物质排出体外来保护视网膜,这种特性也可能会引起疾病,比如:视网膜血管的渗漏和新生血管,炎性物质转移,因此,视网膜内皮细胞在视网膜缺血性病变,血管炎中起到重要作用,包括糖尿病视网膜病变和视网膜炎症或感染尤其是后葡萄膜炎。使用基因表达和蛋白质组学分析等研究方法,有助于了解这些疾病的发病机制。为了进一步开展对糖尿病视网膜疾病的研究,有必要就目前有关糖尿病视网膜病变患者微血管内皮细胞的研究进展予以综述,旨在为糖尿病视网膜病变的深入研究提供参考依据。     

微血管内皮细胞的分离、纯化、鉴定及基因转移的研究

用胶原酶消化,梯度离心,LDL-FACS法分离及纯化小鼠肺组织微血管内皮细胞(MLMEC),并根据细胞形态及间接免疫荧光法加以鉴定。纯化后的MLMEC形态为多边形、短梭形,呈鹅卵石样排列;它能摄取RB-DiL-Ac-LDL,从而胞浆内出现亮红色颗粒;用抗PECAM抗体间接免疫荧光染色后细胞接触处呈亮绿色,细胞轮廓清晰可见。用感染法将HSV-TK基因转入MLMEC细胞内,用XTT法显示携带有HSV-TK基因的MLMEC/TK化及基因转移方法的建立将为研究MLMEC在各种病理状况下的作用及作为基因治疗的载体提供体外模型。     

原代小鼠肺微血管内皮细胞的培养及鉴定

目的建立一种简单高效的小鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法。方法选取2～3周ICR小鼠,剪开胸腹腔,取距离肺边缘约1.5mm组织,剪碎成米粒状,置于含有培养液的离心管中,离心洗涤后种瓶进行原代培养。通过细胞形态学观察、细胞Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色鉴定所培养的细胞。结果接种24h后,红细胞从贴壁的肺组织块边缘向四周游离;48h后,肺微血管内皮细胞爬出,单个细胞形态为多角形或短梭形,细胞间隙较大,胞核清晰,胞浆丰富;96h后细胞融合,呈典型的单层、铺路石样镶嵌式排列。细胞Ⅷ因子免疫细胞化学染色检测,胞质呈棕红色,表达为阳性,阳性细胞率达98%以上。结论随机组织块法能够成功高效分离培养出原代小鼠肺微血管内皮细胞。     

肺微血管内皮细胞的原代培养

目的:建立简单高效获取大鼠肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)的培养方法.方法:(1)组织块贴壁法培养大鼠PMVECs;(2)光镜下观察细胞的形态;(3)扫描电镜和透射电镜分别观察细胞表面及内部的结构特征;(4)免疫荧光法鉴定PMVECs.结果:(1)获得的PMVECs长满后呈典型的铺路石或鹅卵石状;(2)扫描电镜下可见内皮细胞表面存在微绒毛等特殊结构;(3)透射电镜观察可见细胞浆内存在韦伯潘力氏小体(Webel Palade body,WPB);(4)免疫组化结果显示细胞浆中有Ⅷ因子相关抗原存在.结论:改良的组织块法培养肺微血管内皮细胞是一种简单、快捷,有效的方法.     

运用植块法培养脑微血管内皮细胞

探讨简易可行的脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs培)养方法,为研究BMECs细胞在脑血管疾病中的重要作用提供技术支持。分离出生后1~7天内的SD乳鼠大脑皮质区,植块法培养BMECs细胞。用倒置显微镜观察BMECs细胞的形态以及从皮质块迁出的过程;MTT比色法检测BMECs细胞的生长曲线;采用免疫组化染色检测VIII因子相关抗原和CD34抗原,以鉴定内皮细胞。结果发现,大脑皮质块植块法培养的大鼠BMECs细胞呈单层贴壁生长,细胞形态以长梭形、多角形三角形、四边形为主,呈典型的“铺路石”样征象,经鉴定为内皮细胞,第三代纯度达95%以上。提示该方法具有经济、简便、要求条件不高,易于纯化的优点,可作为大鼠BMECs细胞体外培养的良好模型。     

微血管内皮细胞的分离方法

微血管内皮细胞（ＭＥＣｓ）既是被动屏障又主动参与机体许多生理和病理过程。ＭＥＣｓ的分离培养是研究其形态和功能不可缺少的手段。本文介绍了目前常用的和最新的ＭＥＣｓ的分离方法     

单筛过滤法体外分离培养原代大鼠脑微血管内皮细胞及其鉴定

目的 采用单筛过滤法获取脑微血管以培养纯度高、活性好的原代大鼠脑微血管内皮细胞。方法 取4周龄SD大鼠脑皮质,经剪碎、单层细胞筛网过滤、收集网上截留组织、Ⅱ型胶原酶消化后,置于CO₂培养箱中进行原代培养。通过细胞形态学观察、第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色检测鉴定所培养的目的细胞。结果 体外培养24 h后,短梭形细胞从脑微血管段周围爬出;48 h后“岛屿状”的细胞团簇形成;96 h后细胞融合,呈典型的单层、“铺路石样”、镶嵌式贴壁生长。第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色检测显示细胞胞质呈现棕红色,表达为阳性。结论 单筛过滤法能够成功分离培养出原代大鼠脑微血管内皮细胞。     

大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定

取大鼠周边肺组织进行肺微血管内皮细胞培养。将肺组织切成小块,用含有２０％新生牛血清、肝素９０μｇ／ｍｌ、Ｌ－谷胺酰胺４ｍｍｏｌ、青霉素１００Ｕ／ｍｌ和链霉素１００μｇ／ｍｌ的ＲＰＭＩ－１６４０培养基培养。血细胞立即从肺组织周围游出。继而是肺微血管内皮细胞。成纤维细胞及其他细胞７２ｈ才游出。培养６０ｈ后取出肺组织块,培养瓶中只有微血管内皮细胞和血细胞。后者可通过传代除去。获得的肺微血管内皮细胞具有规律的鹅卵石样形态和对异植物血凝素结合试验及八因子相关抗原免疫荧光染色均阳性。     

鲤鱼管内皮细胞的分离培养及初步鉴定

鲤动脉球内灌注0.1％胶原酶消化,分离到大量内皮细胞及少量成纤细胞,28℃,在加入蛋白含量为：350μg/mL鲤下丘脑粗提液的1640＋20％小牛血汪培养液中,细胞生长良好,7d后,接近单层。原代经三次0.5％柠檬酸胰酶消化逐步淘汰少量成纤维细胞,10d后,得纯内皮细胞,并顺利传至二代,第二代细胞经血凝ⅧR因子酶标检测发现,培养细胞存在血凝ⅧR因子相同抗原,具有内皮细胞的一般特征,从而得到初步鉴定。     

视网膜神经节细胞的纯化和体外存活

我们用特异性抗体Thy1.1结合尼龙筛方法分离和纯化新生大鼠视网膜神经节细胞,比较顶盖提取液对这些纯化细胞的作用。预先以快蓝(fast blue,FB)逆行标记的视网膜细胞悬液,接种在包被了Thy1.1抗体的培养皿上30分钟,冲洗未粘附的细胞,显微镜下计数粘附细胞中FB标记的视网膜神经节细胞纯度的百分比,最高为95%。用孔径15μm尼龙筛方法分离的纯度仅为60±5%。上述两种方法纯化的视网膜神经节细胞,仅在有顶盖提取液存在时,细胞存活并生长活跃,胞体大且有突起伸出。MTT微量比色法测定培养24小时纯化细胞存活的光密度(OD)值,显示以Thy1.1特异性抗体纯化的细胞,其OD值比值(+Te/-Te)是12.3(0.111/0.009);以尼龙筛纯化的OD值比值(+Te/-Te)是6.4(0.102/0.016);未经纯化的OD值比值(+Te/-Te)是3.8(0.095/0.025)。在上述三组中,加Te与无Te细胞生存的OD值比较,相差均非常显著(P<0.01)。结论:在纯化的视网膜神经节细胞的培养中,由于排除了其他细胞所引起的非特异性反应,神经节细胞能够更直接地反映顶盖提取液的生物效应;视网膜神经节细胞纯度越高,其作用越显著。     

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF BOVINE BRAIN CATHEPSIN D

Bovine brain cathepsin D was purified 1774-fold with a 19% recovery by affinity chromatography on immobilized pepstatin. Approximately 2 mg of enzyme protein were isolated from 150 g (wet weight) of bovine brain. The enzyme eluted from gel filtration as a single peak with a molecular weight of 40,000–42,000. On polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate, the predominant band migrated with a molecular weight of 48,000: however, less distinct bands were also present in the molecular weight ranges of 31,000 and 13,000. The isolated enzyme had isoelectric points over a range of pH 5–7 with 3 major peaks occurring at pH 5.6, 6.1, and 6.6. The amino acid composition of brain cathepsin D showed substantial differences from that reported for cathepsin D isolated from bovine spleen. Amino-terminal sequence analysis revealed an Asp-Val-lle sequence by Edman degradation. With hemoglobin as the substrate the enzyme had an apparent K, of 60mM.     

牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养

分别用胶原酶Ⅲ和胰蛋白酶成功地分离了牛胎儿成纤维细胞,并对其进行了体外培养,同时探讨了两种酶消化分离牛胎儿组织的时间对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。用组织块直接培养也成功得到了牛胎儿成纤维细胞,并探讨了不同组织块大小对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。通过绘制生长曲线,可以研究牛胎儿成纤维细胞增殖规律;通过制备牛胎儿成纤维细胞的细胞染色体发现,经过传代(12代)、冷冻保存、解冻,牛胎儿成纤维细胞染色体数目不变。     

胞内钙平衡在培养的牛主动脉内皮细胞低氧和复氧损伤中的作用

本文通过建立培养的牛主动脉内皮细胞体外低氧复氧模型,观察低氧和复氧时胞内钙浓度的改变与存活率的关系。结果显示,随低氧时间延长内皮细胞存活率下降,低氧后再复氧存活率进一步降低。低氧时无钙溶液孵育降低细胞的存活率,但复氧时无钙溶液孵育则增加细胞的存活率。低氧２ｈ胞内钙浓度从９９ｎｍｏｌ／Ｌ降对６９ｎｍｏｌ／Ｌ,无钙时胞内钙进一步降低,低氧４ｈ再复氧４０ｍｉｎ,胞内钙浓度恢复至正常。提示细胞内钙浓度平衡     

牛耳成纤维细胞的培养

体细胞克隆是一种新型、高效且极具生产潜力的繁殖技术,在家畜改良和育种工作中前景广阔.在进行持续且大量的家畜克隆生产中,保证取材方便并不影响供体动物健康是十分关键的,只有这样才能使优势供体源本基因不会受到损害.     

FURTHER CHARACTERIZATION OF BOVINE KERATOHYALIN

Extraction of serial sections of cattle hoof epidermis with solutions of calcium chloride, magnesium chloride, potassium chloride, sodium chloride, guanidine hydrochloride, ammonium sulfate, and potassium phosphate buffer (pH 7.0) at varying salt concentrations demonstrates that keratohyalin (KH) is extracted by these salts at certain molarities. Under given conditions of time and temperature, each salt has a specific extraction pattern, and similar salts have similar extraction patterns. Dialysis of the salt extracts of hoof epidermis against distilled water results in the macroaggregition of KH, as assayed by histochemical methods. Although the various macroaggregates appear identical at the histochemical level, they display different ultrastructural characteristics. Polyacrylamide gel electrophoresis of the sodium decyl sulfate-solubilized macroaggregates results in the fractionation of a 20 (or more) member homologous series of oligomers. Isolation of the various oligomeric species of bovine keratohyalin and re-electrophoresis indicate that the various KH species can undergo depolymerization. Amino acid analyses of the unfractionated bovine macroaggregates and the various molecular weight species of bovine KH are similar, further demonstrating homology of the oligomers. The molecular weight of the subunit (monomer) of bovine KH is 14,955, estimated from the amino acid analyses.     

RETINAL GANGLION CELL SIZE AND DISTRIBUTION PREDICT VISUAL CAPABILITIES OF DALL'S PORPOISE

The structure of the retina, the distribution of ganglion cells, and the extent of the tapetum lucidum were studied in Dall's porpoise ( Phocoenoides dalli ) with the aim of understanding the role vision plays in this species of cetacean. The basic organization of the retina was similar to that of other vertebrates. Average ganglion cell size was 21.5 μm. The distribution of the ganglion cells in the retina was not even and there were two high-density areas, one in the temporal and one in the rostral part of the retina. Retinal resolving power was estimated using a terrestrial animal model incorporating the density of ganglion cells and other morphological data. The resolving power in the right eyes of two individuals was 2.60 and 2.64 cycles per degree. These values were close to those of other oceanic cetaceans, but inferior to those of terrestrial mammals. On the basis of amino acid analyses, it was shown that the choroid tapetum lucidum in Dali's porpoise contained collagen. The tapetum lucidum was thick at the fundal but thin at the peripheral part of the choroid.