小麦原生质体高效转化体系的建立

植物原生质体广泛应用于植物基因功能研究中,包括瞬时基因表达、亚细胞定位、蛋白互作和蛋白活性分析等。当前,小麦基因的亚细胞定位和功能分析,大多利用模式植物拟南芥等异源的原生质体,易于造成研究结果的不准确。为避免这种情况,小麦原生质体制备及高效转化体系的建立与应用是必需的。在PEG介导的小麦原生质体转化过程中,原生质体分泌的核酸酶大量降解质粒DNA,转化效率的提高因此受到阻碍。为了建立小麦原生质体的高效转化体系,本文测试了抑制胞外核酸酶活性的因素和提高质粒DNA浓度等多个条件对转化效率的影响。结果表明,转化过程中加入双倍用量的质粒DNA进行转化,且始终保持低温环境(1℃)用以抑制核酸酶酶活性,可以使小麦原生质体的转化效率提高至85%。本文还将该系统成功地应用于2个小麦抗病相关蛋白的亚细胞定位研究,证明了该系统的高效性和实用性。该研究对未来相关研究有一定参考价值。     

农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化

【目的】将农杆菌介导的转化应用于重要的工厂化栽培食用菌斑玉蕈中,建立稳定的农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化技术。【方法】将构建的双元载体pYN6982转入农杆菌LBA4404菌株中,以斑玉蕈SIEF3133菌株打碎的双核菌丝为受体材料,利用根癌农杆菌介导的转化方法进行斑玉蕈转化试验。【结果】经潮霉素抗性筛选、PCR鉴定以及有丝分裂稳定性试验验证,表明潮霉素磷酸转移酶基因(hph)已经整合到斑玉蕈的基因组中;转基因斑玉蕈菌丝在荧光显微镜下可以观测到绿色荧光,表明增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)已经在转基因斑玉蕈菌株中获得了表达;通过PCR检测,随机挑选的8个转基因斑玉蕈菌株中有2个可以扩增出载体转移DNA(T-DNA)边界重复序列外的卡那霉素基因(kan)序列。【结论】获得了稳定遗传和表达的斑玉蕈转基因菌株,建立了农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化方法。农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化中,存在载体T-DNA边界重复序列之外的DNA序列转移到转基因斑玉蕈中的现象,有待进一步研究。     

漆酶同工酶基因在斑玉蕈生长发育过程中的表达分析

为了探明漆酶在斑玉蕈生长发育过程中的功能,对斑玉蕈转录测序预测的13个漆酶基因序列进行分析、鉴定和构建分子系统发育树;检测了不同生长发育时期漆酶的活性和漆酶基因表达水平。研究结果显示：13个基因片段中有10个是漆酶基因。不同的漆酶同工酶之间进化关系存在明显差异,大多数漆酶与木腐菌（金针菇Flammulina filiformis和侧耳属Pleurotus）进化关系较近。对斑玉蕈不同生长发育时期的酶活检测结果显示,从斑玉蕈的菌丝恢复期到钉头期,漆酶活性逐渐升高,而在子实体形成后期酶活逐渐降低。对培养40d、60d和80d的菌丝样品以及不同生长发育时期的样品进RT-qPCR检测,结果显示在菌丝营养生长时期,大多数漆酶基因在第40-60天表达量持续增加1-3倍,而在第60-80天时表达量出现降低的情况。而在生殖生长时期,大多数漆酶基因在转色期或者原基期相对表达量达到最大值,并在子实体期出现降低,这与漆酶活性的检测具有一致性。lcc3、lcc7、lcc8和lcc9在斑玉蕈生殖生长过程中相对表达量出现了10-100倍的上调。这说明从菌丝培养到菌丝扭结形成子实体和子实体发育的过程中,不同的漆酶可能发挥着不同的作用,表达量较高的漆酶基因可能对基质降解和子实体形成起主要作用。     

植物系统学研究中常用基因分子标记特点分析

阐述了目前用于植物系统学和进化研究的一些常用的ＤＮＡ分子标记技术,分析了各自的使用范围和应用特点,提出在使用这些分子标记来研究分子系统学时必须注意的问题。     

作物基因聚合分子育种

基因聚合分子育种与常规育种技术相结合已成为今后作物育种的主流方向。基因聚合分子育种主要包括遗传转化基因聚合分子育种和分子标记筛选基因聚合分子育种。本文简要综述了近年来作物基因聚合分子育种的研究进展,分析了遗传转化基因聚合分子育种以及分子标记基因聚合分子育种技术的研究方法及基因聚合分子育种存在的问题。     

PEG介导的猴头菌遗传转化体系的建立

对猴头菌Hericium erinaceus原生质体制备的各种因素进行比较研究,结果表明,猴头菌原生质体制备的最佳体系为：液体培养5d的猴头菌丝,以0.6mol/L KCl作为稳渗剂,加入含1.0%纤维素酶+1.0%蜗牛酶+1.0%溶壁酶的复合酶,在30℃酶解猴头菌丝3h时,原生质体得率达到3.0×106个/mL。潮霉素敏感性测试表明,猴头菌在PDSA固体培养基上的潮霉素最低筛选浓度为60μg/mL。采用PEG介导的原生质体法,将质粒pBgGI-hph（含有灵芝gpd1-Gl启动子和潮霉素抗性基因hph）转化猴头菌原生质体,经潮霉素初步筛选以及PCR鉴定,表明有4株猴头菌拟转化子的基因组扩增出hph基因;转化子经过多次转接后进行Southern杂交验证,结果表明4个转化子的基因组中均稳定整合了hph抗性基因。     

博落回遗传转化体系的初步建立

博落回是一种重要且应用广泛的药源植物,市场前景广阔。现以博落回无菌苗叶片为材料,通过优化卡那霉素和头孢霉素两种抗生素的浓度,初步建立了博落回遗传转化体系,同时利用农杆菌介导法将MtDREB1C基因导入博落回,获得卡那霉素抗性植株。随机抽取50株转基因植株进行PCR鉴定,其中3株成功扩增出了目的条带,经初步统计,获得博落回阳性苗的概率是6%。实验结果表明植物基因工程技术可作为博落回遗传改良的新途径,为博落回分子育种奠定基础。     

亚麻遗传转化体系的建立及几丁质酶基因导入的研究

报道了亚麻遗传转化体系的建立和几丁质酶基因对亚麻遗传转化的研究。亚麻下胚轴切段培养在不同激素浓度的ＭＳ培养基上,诱导分化出不定芽。最佳的激素组合是ＭＳ＋ＢＡ１ｍｇ／Ｌ＋ＩＡＡ０．５ｍｇ／Ｌ,分化频率可达９７％。亚麻的下胚轴经带有几丁质 根癌农杆菌感染后,在含有１００ｍｇ／Ｌ卡那霉素的选择分化培养基上,１４￣２１ｄ就能产生抗生小芽,小芽进一步伸长后可在１００ｍｇ／Ｌ卡那霉素的ＭＳ选择生根培养基（ＭＳ     

工业酵母菌株转化体系的建立

本文通过敏感度实验测定了工业酵母菌株SK—1、SPSC—1、NAN—27在不同的培养基上对G418及Cu^2 的敏感浓度,确定了3株工业菌株转化子的筛选方法。针对它们各自的生理生化、遗传特性,用改进的醋酸锂完整细胞转化和原生质体转化两种方法,分别建立了3株菌的转化系统,初步解决了工业酵母菌株转化的问题,并为下一步工业酵母菌株的代谢工程改造奠定了基础。     

斑玉蕈酸性磷酸酯酶的酶学性质研究

以斑玉蕈为材料分别从菌盖和菌柄中提取一种酸性磷酸酯酶（ACPase,EC.3.1.3.2）,进一步用硫酸铵沉淀分离,Sephadex G-200柱纯化,从菌盖中分离到3个酶组分,从菌柄中分离到4个酶组分,分别对菌盖和菌柄的酶Ⅰ和酶Ⅰ′进行聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳纯度鉴定,均呈现单一酶蛋白带。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定酶Ⅰ和酶Ⅰ′的相对分子量均为65kDa,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Sephadex G-75凝胶过滤测定分析,酶Ⅰ和酶Ⅰ′均为单亚基蛋白。紫外吸收光谱（UV）测     

Molecular analysis of genomic DNA-mediated transformation in Zea mays

Total genomic DNA isolated from maize hygromycin B resistant cell line(hygr-G204) was used to transform the maize hygromycin B sensitive cell line(hygs-G204) to the hygr-phenotype using polyethyleneglycol treatment and the transformed calli were selected using hygromycin B. The primary transformant maize plants were regenerated and analysed at the molecular level using DNA hybridization, transgenome rescue and histochemical β-glucuronidase assay. The results indicated that genomic DNA-mediated transformation can lead to transfer, expression and stable integration of a DNA fragment into the host genome. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

跨界原生质体融合菌Xhhh基因组分子鉴定

Xhhh是由真核、原核两界生物3个亲株PC、SC、XZ的原生质体跨界融合而成的基因工程茵。本研究以Xhhh及其三亲株（PC、SC、XZ）的基因组DNA为扩增模板,筛选出的38条引物,应用随机扩增多态性DNA（R虹,D）技术扩增出739条清晰条带,平均每条引物扩增出了7条清晰可重复的条带。通过聚类分析,结果显示Xhhh与PC、SC与XZ的遗传相似指数S1分别为36．21％、37．73％和37．48％,提示Xhhh与三亲株间存在明显的亲缘关系。研究同时根据已公布的mnp、zip以及FLO1核酸序列设计了相应的功能基因引物,并从Xhhh及其亲株中扩增出了mnp、lip以及FL01功能基因片段,表明RAPD结合功能基因PCR扩增技术可以快速、经济、准确的用于跨界原生质体融合茵株的分子鉴定,以及其它融合子的鉴定。     

基因组重排技术在酵母菌育种中的应用

基因组重排(genome shuffling)技术是在传统诱变育种的基础上与细胞原生质体融合技术相结合一种新兴微生物菌种改良手段,由于该技术高效的正向突变效率和频率,近年来被广泛应用于酵母菌种的选育和改良。本文主要对基因组重排技术在酵母菌育种中的应用进行了综述。     

一种有效的双孢蘑菇原生质体制备及瞬时转化体系

原生质体的制备与再生是双孢蘑菇进行遗传转化的基础,通过研究得到制备双孢蘑菇原生质体的最佳条件是：取培养15d的菌丝振荡培养7d,溶壁酶浓度为1mg/mL的0.6mol/L KCl酶解液、温度30℃、45r/min条件下摇培10h,经过富集精制后的原生质体（4×10 ⁶/mL）可进行瞬时转化。利用Ab-eGFP进行转化,在20min、24h、48h后可观察到GFP荧光,并且在24h和48h可恢复细胞壁增殖,瞬时转化后亦可复壁增殖。研究结果为双孢蘑菇原生质体的稳定遗传转化及后续利用原生质体建立CRISPR-Cas9基因组编辑系统等提供一定的理论依据。     

PEG介导的黑附球菌遗传转化体系的建立

以生防真菌黑附球菌原生质体为受体、潮霉素抗性基因（ hph）为筛选标记,应用PEG介导法进行了遗传转化体系的研究。潮霉素敏感性测试结果表明,黑附球菌对潮霉素的耐受浓度为50mg/L。PEG介导的黑附球菌原生质体最佳遗传转化体系为：30℃下用2%裂解酶酶解黑附球菌菌丝2h,过滤收集原生质体,经MTC清洗重悬后将质粒pYF11-hph转化黑附球菌原生质体,在RM培养基中混匀再生;经潮霉素药剂筛选和PCR验证,表明外源基因 hph已转入到黑附球菌中并获得稳定表达。本实验成功地建立了稳定的PEG介导的黑附球菌遗传转化体系,为研究其代谢途径、生防机制及构建工程菌株提供了技术保障。     

“红颜”草莓原生质体制备及瞬时转化体系的建立

为探索“红颜”草莓悬浮细胞系原生质体提取的最优条件,并建立“红颜”草莓原生质体瞬时转化体系,以“红颜”草莓悬浮细胞为材料,对酶液组成、酶解温度、酶解方式进行研究。用PEG介导的瞬时转化法将标记基因GFP转化到“红颜”草莓原生质体中。结果显示：以“红颜”草莓悬浮细胞系作为分离材料,酶液组合为CPW中含有0.5%PVP+0.1%MES+1%纤维素酶+0.5%离析酶+0.01%半纤维素酶+0.9 mol/L甘露醇,在低速（50 r/min）恒温（31 ℃）震摇下进行酶解反应,酶解10 h时,达到“红颜”草莓原生质体最佳分离效果,每克鲜重产量可得原生质体6×10⁸ 个,活力值可达93.0%。PEG介导法成功将含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的植物表达载体转化“红颜”草莓悬浮细胞原生质体,转化效率达44%。通过实验筛选得到“红颜”草莓悬浮细胞原生质体的最佳制备条件,建立“红颜”草莓悬浮细胞原生质体的瞬时转化体系,为进一步开展“红颜”草莓功能基因及合成生物学研究奠定基础。     

Herbicide-resistant Indica rice plants from IRRI breeding line IR72 after PEG-mediated transformation of protoplasts

The commercially important Indica rice cultivar Oryza sativa cv. IR72 has been transformed using direct gene transfer to protoplasts. PEG-mediated transformation was done with two plasmid constructs containing either a CaMV 35S promoter/HPH chimaeric gene conferring resistance to hygromycin (Hg) or a CaMV 35S promoter/BAR chimaeric gene conferring resistance to a commercial herbicide (Basta) containing phosphinothricin (PPT). We have obtained so far 92 Hg^r and 170 PPT^r IR72 plants from protoplasts through selection. 31 Hg^r and 70 PPT^r plants are being grown in the greenhouse to maturity. Data from Southern analysis and enzyme assays proved that the transgene was stably integrated into the host genome and expressed. Transgenic plants showed complete resistance to high doses of the commercial formulations of PPT.     

深海白色侧齿霉遗传转化体系建立及渗透压调控相关的EaSHO1基因功能

海洋中具有丰富的动植物及微生物资源,海洋真菌是其重要组成之一。我们前期的研究发现一株深海真菌白色侧齿霉Engyodontium album能产生具有抑菌活性的次级代谢产物engyodontiumin A,该化合物能抑制黑曲霉、金黄色葡萄球菌及创伤弧菌等病原菌的生长,是一种潜在的海洋源抗菌药物。目前,该菌遗传转化体系尚未建立,不利于开展次级代谢产物合成调控机制及其他功能基因研究。本研究成功制备了深海白色侧齿霉菌的原生质体,建立了借助聚乙二醇3350介导的原生质体转化体系,并将pCT74-sGFP载体成功导入白色侧齿霉的原生质体中,结果显示外源GFP能稳定表达。此外,为了明确白色侧齿霉菌是否能够开展基因敲除研究,通过氨基酸序列同源比对,我们选取酵母高渗甘油信号途径中的同源基因EaSHO1进行初步探究。利用同源重组的方法成功将目的基因EaSHO1的开放阅读框(ORF)替换成潮霉素磷酸转移酶基因(HPH),由此获得EaSHO1基因敲除突变体,并对突变体进行Southern杂交验证及初步的表型分析。结果表明,EaSHO1缺失不影响白色侧齿霉菌的营养生长及对高盐胁迫的响应,亚细胞定位结果显示EaS...