一种更有效的肝癌靶向性条件复制型腺病毒的构建及体外抑瘤作用

目的:分别构建以甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)300bp启动子和800bp增强子-300bp启动子调控复制的条件复制型腺病毒(CRAd),对两种病毒的务件复制性以及溶瘤作用进行比较,为肝癌靶向性治疗提供更优良的载体.方法:以HepG2基因组DNA为模板,PCR扩增AFP基因启动子(AFPp)和增强子(AFPe),构建表达质粒pAFPp-EGFPluc和pAFPep-EGFPluc,通过检测报告基因EGFP和luciferase的表达鉴定启动子和增强子的活性后,构建穿梭质粒pDC311-AFPp-E1A,pDC311-AFPep-E1A并包装出腺病毒Ad.AFPp-E1A和Ad.AFPep-E1A.利用Western blot、病毒增殖、细胞病变、细胞活力等鉴定并比较两种病毒的复制能力和溶瘤作用.结果:Ad.AFep-E1A和Ad.AFPep-E1A均可在AFP阳性细胞中选择性复制并且具有一定的溶瘤作用,以后者的选择复制性和溶瘤性更为明显.感染病毒Ad.AFPp-E1A后的HepG2、Hep3B细胞的存活率分别为(54.23±7.13)%、(61.18±12.63)%;感染病毒Ad.AFPep-E1A后的HepG2、Hep3B细胞存活率分别为(26.65±5.43)%、(24.49+3.31)%.结论:被截短的800bp增强子片断,在对AFP启动子起到增强作用的同时,可以为腺病毒包装进更多的治疗基因提供空间,从而为肝癌靶向治疗提供更为良好的条件复制型病毒载体.     

构建溶瘤腺病毒的策略

溶瘤腺病毒是通过遗传工程改造的腺病毒,具有溶细胞复制周期的特性和特异靶向肿瘤细胞和裂解肿瘤细胞的功能。溶瘤腺病毒通过复制、释放子代病毒感染邻近肿瘤细胞。现在对腺病毒生活周期的认识水平,可以对其基因组进行改造从而使其特异性裂解肿瘤细胞而不杀伤正常细胞,并且构建了多种溶瘤腺病毒。本文主要概述了溶瘤腺病毒的三种构建策略:剔除腺病毒在正常细胞中复制所必需而在肿瘤细胞中不需要的某些基因;利用肿瘤特异性启动子控制病毒复制所必需的基因;对腺病毒衣壳蛋白进行基因修饰,达到特异性结合肿瘤细胞的目的。     

一种新的重组腺病毒的构建及其对人肿瘤细胞的影响

腺病毒E1A基因诱导细胞凋亡,E1B19K基因及E1B55K基因抑制细胞凋亡,前者被克隆到腺病毒转移载体pCA13的HCMV IE启动子下游,构建成转移载体pCAE1A.采用lipofectin法将pCAE1A和含腺病毒基因组(E1区、E3区缺失)的质粒pBHG11共转染293细胞,7～10 d后得到重组病毒v5Ad4.用v5Ad4感染人肺腺癌细胞系A549,结果表明v5Ad4有明显杀伤和裂解肿瘤细胞功能.在人胚肺正常二倍体细胞中,v5Ad4没有表现出可见的细胞毒效应.     

一种新的重组腺病毒的构建及其对人肿瘤细胞的影响

腺病毒E1A基因诱导细胞凋亡．E1B19K基因及E1B55K基因抑制细胞凋亡,前者被克隆到腺病毒转移载体pCA13的HCMVIE启动子下游．构建成转移载体pCAE1A。采用lipofectin法将PCAE1A和含腺病毒基因组（E1、E3区缺失）的质粒pBHG11共转染293细胞,7～10d后得到重组病毒v5Ad4。用v5Ad4感染人肺腺癌细胞系A549,结果表明v5Ad4有明显杀伤和裂解肿瘤细胞功能。在人胚肺正常二倍体细胞中,v5Ad4没有表现出可见的细胞毒效应。     

选择性复制型腺病毒介导的自杀基因HSV -tk 在肿瘤基因治疗中的应用

自杀基因治疗是肿瘤基因治疗的手段之一,治疗效果与自杀基因能否被高效、选择性的导入肿瘤细胞有关。肿瘤选择性复制型腺病毒（conditionally replication adenovirus,CRADs）可以特异性的在肿瘤细胞中复制,在复制的同时所携带的治疗基因也大量表达。由CRAds介导的自杀基因,实现了对肿瘤的病毒治疗和基因治疗的结合,提高了治疗效率和使用复制型腺病毒的安全性。     

禽腺病毒QU株一个复制非必需区的鉴定

禽腺病毒QU弱毒株属于鸭腺病毒1型病毒, 可作为潜在的重组疫苗载体。为确定QU株的复制非必需区, 参照鸭腺病毒1型病毒基因组右侧E4区附近序列设计引物, 扩增QU株基因组的一段3.4 kb片段, 插入来自pEGFP-C1质粒的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达盒片段, 构建了含EGFP基因的重组质粒pADGFP。采用脂质体介导法, 将重组质粒pADGFP与QU株共转染CEF细胞, 用96孔板稀释法筛选纯化表达绿色荧光蛋白的重组QU病毒株rQUGFP。该重组毒的生长曲线与亲本毒一致, 连续传代后病毒滴度稳定。结果表明, QU株基因组右侧E4区附近一段包括ORF1、ORF8和ORF9三个开放阅读框的区域为病毒的复制非必需区, 且插入的EGFP基因可以稳定表达。为进一步以禽腺病毒QU株为载体构建重组疫苗的研究打下基础。     

含CD自杀基因腺病毒载体的构建及其应用

构建了含ＣＭＶ启动子、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ｃｄ）基因的复制缺陷型重组腺病毒载体（ＡｄＣＭＶＣＤ）。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＲＴ－ＰＣＲ鉴定证实,ｃｄ基因已克隆进入ＡｄＣＭＶＣＤ,并在受染细胞中表达。经氯化铯密度梯度离心法纯化的病毒滴度达１×１０１５ｐｆｕ／Ｌ。经１００ｍ．ｏ．ｉ．的ＡｄＣＭＶＣＤ感染的ＨｅＬａ和Ｃ６细胞株在１００μｍｏｌ／Ｌ５ＦＣ处理后,细胞存活率＜２０％。同时也观察到ＡｄＣＭＶＣＤ／５ＦＣ系统有很强的旁杀伤效应,将３．３％的ＡｄＣＭＶＣＤ受染细胞与９６．７％的野生型细胞混合,经５０μｍｏｌ／Ｌ５ＦＣ处理后,＞６０％的细胞被杀死。ＡｄＣＭＶＣＤ／５ＦＣ系统的建立为肿瘤基因治疗的研究提供了新的手段。     

可诱导肿瘤靶向性IFN-α2a重组腺病毒的构建及其表达

腺病毒载体广泛应用于恶性肿瘤的靶向性基因治疗的研究,但这些肿瘤靶向载体缺乏可控性,其疗效和安全性受到很大的影响,因此开发新型可诱导的生物肿瘤靶向载体是当今抗肿瘤靶向药物研究的当务之急。该研究构建了可诱导肿瘤靶向性IFN-α2a重组腺病毒。重组腺病毒能够有效感染人肝癌细胞株HepG2等多种肿瘤细胞株,RT-PCR和Western blot结果表明肿瘤细胞能高效表达IFN-α2a,而其非肿瘤细胞株L02几乎没有表达。诱导试验表明重组腺病毒Ad MT-Ⅱ-hTERT/IFN-α2a能被ZnSO4诱导表达。可诱导肿瘤靶向性重组腺病毒Ad MT-Ⅱ-hTERT/IFN-α2a成功构建为下一步体内外抑癌实验研究打下了基础。     

人呼吸道合胞病毒M蛋白非复制型重组腺病毒的构建和鉴定

人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus, RSV)基质蛋白（matrix protein,M）在RSV形态发生上具有重要作用,因含有CTL抗原表位,在疫苗研究上具有一定意义。为此,应用RT-PCR 方法从感染RSV的HEp-2 细胞中扩增获得M蛋白基因,构建了含M基因的非复制型重组腺病毒并进行表达和鉴定。基因序列分析显示RSV M基因仅有一处碱基发生错义突变。非复制型重组腺病毒DNA分子FGAd/RSVM转染293细胞,观察到细胞出现CPE,RT-PCR发现M基因有转录,Western blotting及间接免疫荧光分析检测到M蛋白。成功克隆A亚型RSV Long株M基因,并获得一株可表达A亚型RSV M蛋白的非复制型重组腺病毒FGAd/RSVM,可用于体内研究观察其免疫效果及免疫保护作用。     

增殖型腺病毒的改良及应用

增殖型腺病毒能在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞,释放出的子代病毒再感染邻近肿瘤细胞直至完全杀灭肿瘤,却不影响正常细胞的功能。同时,增殖型腺病毒还是一种有效的基因治疗载体,可通过病毒自身增殖提高目的基因的拷贝数,从而更高效率地表达外源性治疗基因,增强抗肿瘤效应。本文着重介绍增殖型腺病毒载体改良和应用的最新进展,并对其研究前景进行展望,以期对增殖型腺病毒的发展有所帮助。     

Conditionally Defective Helper Adenoviruses and Satellite Virus Replication

ADENO-ASSOCIATED satellite viruses (ASV) are extremely defective in that they need a helper adenovirus to complete their replication cycle in susceptible cells^1–3. Although the helper virus is usually not defective there have been reports of systems which are at least conditionally defective. Smith and Gehle⁴ found that a canine adenovirus, ICH, which did not seem to replicate in human amnion cells (essentially a non-permissive system) could be used to pass the satellite serially in these cells if the passage was reinfected each time with helper virus. Ito et al.⁵ reported that a temperature-sensitive mutant of human adenovirus type 31, ts 13, defective in viral DNA synthesis, could complement a cycle of satellite virus replication at the non-permissive temperature.     

A Multi Targeting Conditionally Replicating Adenovirus Displays Enhanced Oncolysis while Maintaining Expression of Immunotherapeutic Agents

Studies have demonstrated that oncolytic adenoviruses based on a 24 base pair deletion in the viral E1A gene (D24) may be promising therapeutics for treating a number of cancer types. In order to increase the therapeutic potential of these oncolytic viruses, a novel conditionally replicating adenovirus targeting multiple receptors upregulated on tumors was generated by incorporating an Ad5/3 fiber with a carboxyl terminus RGD ligand. The virus displayed full cytopathic effect in all tumor lines assayed at low titers with improved cytotoxicity over Ad5-RGD D24, Ad5/3 D24 and an HSV oncolytic virus. The virus was then engineered to deliver immunotherapeutic agents such as GM-CSF while maintaining enhanced heterogenic oncolysis.     

Development of a Serum-free Suspension Process for the Production of a Conditionally Replicating Adenovirus using A549 Cells

Conditionally replicating adenoviruses (CRAVs) are a group of recombinant human adenoviruses genetically engineered to replicate in selected tissues, such as tumors. These viruses could potentially offer significant medicinal benefits, since the restrictive replication of these viral vectors leads to the lysis of target cells without harm to the surrounding tissues. The in vitro propagation and amplification of the CRAV vectors often requires special host cells with deregulated growth control pathways. In order to develop an efficient cell culture process for the scaleable production of a CRAV vector, A549 cells, a human lung carcinoma cell line normally cultured in adherent culture, were adapted to suspension culture. CRAV production was demonstrated with the suspension-adapted A549 cells and a baseline production process was developed in shake flasks. The ability to scale-up virus production was confirmed in stirred tank bioreactors. Molecular characterization of the suspension-adapted A549 cells indicates no significant changes in cellular mechanisms related to adenovirus infection.     

Construction and Characterization of Hexon-Chimeric Adenoviruses: Specification of Adenovirus Serotype

This study has used the strategy of gene replacement to characterize the contribution of the adenovirus (Ad) capsid protein hexon to serotype definition. By replacing the Ad type 5 (Ad5) hexon gene with sequences from Ad2, we have changed the type specificity of the chimeric virus. The type-determining epitopes are primarily associated with loop 1 of hexon and, to a much lesser degree, with loop 2. In spite of the serotype distinctiveness of the chimeric hexon viruses, epitope similarity between the vectors resulted in a low level of cross-reactive neutralizing antibody, which in combination with activated cellular and innate arms of the immune system is sufficient to suppress gene transduction following readministration in vivo.     

条件性敲除APC基因小鼠肠道腺瘤模型的构建

腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)基因是家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)的致病基因,APC基因的突变导致小鼠多处产生肿瘤,但肠道条件性敲除APC基因后,小鼠的表型并不清楚。该研究利用Cre-LoxP重组酶系统,在肠道绒毛和隐窝上皮细胞条件性敲除APC基因,并对小鼠表型进行鉴定和分析。将Villin Cre小鼠和APC~(fl/fl)小鼠合笼得到Villin Cre;APC~(fl/+)小鼠;有意思的是后者进一步与APC~(fl/fl)小鼠合笼,却没有得到Villin Cre;APC~(fl/fl)小鼠。进一步解剖Villin Cre;APC~(fl/+)小鼠,发现其自发产生肠道肿瘤,并能携瘤生存,免疫组化显示瘤体组织激活了Wnt信号通路。结果表明成功地构建了小鼠肠道条件性敲除APC基因腺瘤模型,为进一步研究APC基因在肠道发育以及肠道肿瘤的作用提供了优良的工具。     

包装信号可以被Cre重组酶切除的辅助性腺病毒的构建及鉴定

目的:为了探索构建第三代复制依赖性腺病毒载体系统的有效实验方法,利用细菌内重组原理,分别构建了第三代腺病毒生产体系中的辅助性腺病毒和表达Cre重组酶的真核表达载体,并分析了Cre切除辅助病毒包装信号的有效性。方法:通过PCR及酶处理法依次将2个同向的loxP位点及绿色荧光蛋白表达盒克隆至pShuttle穿梭载体质粒,按照AdEasy系统的标准实验方法产生和扩增辅助病毒;同时构建pcDNA3.1(+)-cre真核表达载体,并用该载体经脂质体法转染HEK293细胞,通过PCR和流式细胞术分析转染细胞内表达的Cre重组酶对随后感染的辅助病毒的包装信号的切除作用。结果:构建的辅助性腺病毒能够在HEK293细胞内扩增,其包装信号可以由细胞内表达的Cre重组酶有效切除。结论:构建了辅助性腺病毒和pcDNA3.1(+)-cre真核表达载体,为第三代腺病毒的生产奠定了实验基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap),其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-Cap,测定其TCID50为1013.7/mL。用RT-PCR、间接ELISA、Westernblot和IPMA等方法证明了Cap蛋白在腺病毒中获得表达。该研究为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。