铁氰化钾氧化固氮酶钼铁蛋白与铁、钼、硫化合物重组的研究

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白经铁氰化钾氧化后变为“漂白蛋白”,其活性损失约75％,同时释放出80％的钼和50％左右的铁。与铁、钼、硫重组溶液重组,金属组成和乙炔还原活性均得到明显恢复。穆斯鲍尔(M／issbauer)谱表明,重组溶液中的Fe、Mo、S已形成FeMc6原于簇的类似物,“重组蛋白”的M6ssbauer谱和天然MoFe蛋白相似。     

mpt64-卡介苗重组疫苗的构建、免疫原性及抗结核作用

通过基因工程重组技术将结核分枝杆菌保护性抗原MPT64的编码基因与穿梭质粒载体pYUB295重组,采用电穿孔技术将重组质粒导入到卡介苗中,应用聚合酶链反应(PCR)扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对mpt64-卡介苗重组疫苗鉴定:成功地构建了MPT64基因pYUB295重组质粒,MPT64蛋白在卡介苗中能分泌表达....     

蓝藻抗病毒蛋白-N基因的克隆、表达、纯化及活性鉴定

蓝藻抗病毒蛋白-N(Cyanovirin-N,CVN)具有强效抗HIV及其他包膜病毒活性,该蛋白序列特殊,难以重组制备,在大肠杆菌细胞质中形成包涵体。本研究根据大肠杆菌密码子偏好性对CVN原始核苷酸序列进行优化,通过多次PCR合成SUMO-CVN的全长DNA序列,构建pET3c-SUMO-CVN重组表达质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。通过对诱导剂浓度和诱导时间的优化,发现以0.5mmol/LIPTG在20℃诱导24h可获得最高表达,SDS-PAGE结果显示,SUMO-CVN为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的28%;经特异性的SUMO蛋白酶对融合蛋白进行酶切及两步Ni-NTA凝胶亲和层析可以得到纯度较高的重组CVN蛋白。ELISA结果表明,重组蛋白CVN与gp120蛋白有较高的亲和力。体外抗病毒活性实验表明,重组蛋白CVN在纳摩尔浓度具有很好的抗HSV-1和HIV-1/ⅢB活性;这为开发基于CVN的新型、高效抗病毒药物打下了基础。     

猪链球菌Lmb、Sao、ZnuA蛋白的抗原表位、二级结构分析及重组表位疫苗分子的设计

[目的]利用生物信息学方法设计猪链球菌候选疫苗蛋白Lmb、Sao、Znu A的重组表位多肽分子。[方法]通过ABCpred和Bepi Pred方案,预测猪链球菌Lmb、Sao、Znu A蛋白的B细胞表位。运用神经网络与量化矩阵法预测蛋白的CTL表位。使用MHC-Ⅱ类分子结合肽预测蛋白的Th表位。采用DNASTAR软件与SOPMA服务器预测蛋白二级结构,进而验证获得的B/T细胞表位的准确性。通过DNASTAR Protean软件重组拼接获得的B/T细胞抗原表位,设计抗原性较好的猪链球菌重组表位多肽。[结果]猪链球菌Lmb、Sao、Znu A蛋白的优势B细胞表位数分别为4个、4个和3个;CTL表位数各为1个;Th表位数分别为2个、1个和1个。二级结构预测显示这些表位大多处于蛋白易于产生表位的暴露表面、无规则卷曲与转角等位置。并设计获得抗原性较好的重组表位多肽。[结论]设计了抗原性较好的猪链球菌Lmb、Sao、Znu A蛋白的重组表位多肽。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3．1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1—egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45％。瞬时转染pcDNA3．1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

DNA复制、修复与重组

在一些大肠杆菌株系中,RecET是一种噬菌体衍生出的简单而有效的重组系统,它能通过单链退火启动同源重组。一种称作RecE的5’-3’外切核酸酶可以对生成的DNA末端进行再切割,在切口处造成一个3’－单链末端,而重组酶RecT在此末端加载以单链DNA（ssDNA）互补链。     

白蛋白结合肽-多柔比星耦合物的设计、制备、表征及初步评价

为了改善多柔比星在血液中的循环半衰期,基于白蛋白在血浆中含量丰富、性质稳定、半衰期持久的特点,通过大肠杆菌体系重组表达了源于细菌表面蛋白中白蛋白结合肽段,并建立了纯化工艺,获得了纯度高于95%的重组白蛋白结合多肽,并证明重组多肽在体外能够迅速地与人血清白蛋白结合。通过与DOXO-EMCH分子化学耦联,制备获得重组白蛋白结合肽-多柔比星耦合物。A549细胞毒力实验结果显示耦合物的IC50浓度升高,药代动力学结果显示重组白蛋白结合肽能够显著延长多柔比星在血液中的循环半衰期,相对于多柔比星或DOXO-EMCH分别提高了5.6倍和3.8倍。荷瘤小鼠肿瘤生长抑制实验结果显示耦合物的抗肿瘤效力得到提升。证明了基于白蛋白结合机制可为小分子药物长效设计提供新的思路。     

植物减数分裂中的染色体配对、联会和重组研究进展

减数分裂是有性生殖的关键步骤,而染色体配对、联会和重组又是减数分裂的重要环节,也是减数分裂研究的热点之一。近些年来,借助于先进的分子生物学和细胞学技术,通过大量突变体的筛选,在植物减数分裂中染色体的配对、联会和重组研究取得了长足的进展。文章就目前克隆的植物减数分裂中染色体配对、联会和重组相关的基因及功能研究进行了总结,并进一步对其分子机制进行了探讨。     

重组蛋白ES-Kringle5的表达、纯化及活性检测

目的：利用基因工程方法原核表达重组融合蛋白ES-Kringle5并进行纯化及活性检测。方法：ES-Kringle5是将内皮抑素N端的前27个氨基酸与Kringle5通过连接肽相连的重组融合蛋白,合成该重组蛋白的基因片段并插入载体pMD18-T中,然后克隆至大肠杆菌表达载体pET25b中并转化E.coli BL21（DE3）。乳糖诱导表达后经Ni-NTA亲和层析纯化后获得目的蛋白。通过抑制HUVEC细胞增殖实验检测其生物学活性。结果：重组质粒构建正确。利用乳糖诱导表达并降低诱导温度能增加目的蛋白的产量及可溶性表达。纯化后的重组蛋白纯度大于95%。生物学活性证明该重组蛋白具有抑制HUVEC的增殖能力。结论：具有生物学活性的重组蛋白ES-Kringle5可在大肠杆菌中高效表达,为研究其体内药效、药代及安全性评价奠定了基础。     

基因诱变、重组、克隆

930043利用重组DNA技术改良真菌产物的合成[会,英]/Finkelstein,D.B.…/Ann.N.Y.AC—ad.Sci.一1991,646.一202～206E译闩DBA,1992,11(13),92·07231] 对丝状真菌的转化最初是通过同源DNA进行(如用克隆的qa2基因对粗糙链孢霉进行缺陷补偿)。在几乎一半转化子中,DNA通过非同源重组整合到基因组中。发展了几种载体,用于转化野生型丝状真菌(如转化原垓的杀真菌基因,用的是真菌启动子)。在某些实例中,同源基因可以被用作选择标记。针对一些有突变(并容易被补偿)的菌类,发展了相应的选择体系。重组真菌若要进入实用阶段,在大容量发酵罐中…     

弗氏柠檬酸菌dhaT基因的克隆表达、序列分析、酶的纯化及特性研究

1,3-丙二醇（1,3-propanediol,1,3-PD）是一种重要的化工原料,越来越受到广泛的关注。以弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)基因组DNA为模板,通过PCR得到1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanediol dehydrogenase,PDOR) 的基因dhaT,序列显示与来源于C.freundii DSM 30040 (Genbank U09771)相应基因的相似性为78%。将此基因构建于表达载体pSE380,得到重组质粒pSE-dhaT。重组质粒转化到宿主菌E.coli JM109中进行了表达,重组酶通过镍柱及Sephacral S-300进行纯化,重组酶SDS-PAGE结果显示有非常明显的单一的42kDa特异性蛋白条带出现。以丙醛为底物测定重组酶还原反应的最适温度为37℃、最适pH为8.0,对丙醛的Km值为10.05mmol/L,最大反应速度Vmax为37.27umol/ min /mg;以1,3-PD为底物测定重组酶氧化反应的最适温度为25℃、最适pH为10.5,对1,3-PD的Km值为1.28mmol/L,最大反应速度Vmax为25.55umol/min/mg。重组酶的还原反应比活为49.50U/mg,氧化反应比活为79.72U/mg。该酶同样具有假定的结合Fe2+的G-X-X-H-X-X-A-H-X-X-G-X-X-X-X-X-P-H-G模体保守结构。此研究为工程菌高效生产1,3-PD奠定了基础。     

重组芋螺毒素GeXIVAWT的表达、纯化和鉴定

芋螺毒素GeXIVAWT是来自食虫将军芋螺(Conus generalis Lonnaeus)毒管中,具有两对二硫键的28肽.通过化学合成这种芋螺毒素产量低、成本高、难以纯化.利用简单快速的重组表达来生产富含二硫键的芋螺毒素有可能成为有效的新途径.通过对芋螺毒素GeXIVAWT的基因进行密码子优化,人工合成引物来构建表达载体pET22b(+)/pelB-GeXIVAWT.融合了信号肽的重组芋螺毒素以包涵体的形式在大肠杆菌中获得了高效表达.利用低浓度尿素洗涤和超滤管进行纯化无组氨酸标签的重组芋螺毒素pelB-GeXIVAWT,再利用稀释复性的方法将无活性的包涵体转变成具有活性的重组芋螺毒素.复性后的重组蛋白采用反相高效液相色谱进一步纯化后进行了质谱鉴定.活性实验表明重组芋螺毒素pelB-GeXIVAWT具有抑制昆虫细胞Sf-9的生长,为研究芋螺毒素作为生物杀虫剂奠定基础.     

精氨酸、精氨酸盐酸、半胱氨酸、胱氨酸对重组人tPA蛋白复性的影响

以重组人tPA蛋白为材料研究了精氨酸、精氨酸盐酸盐、半胱氨酸、胱氨酸对蛋白质复性效果的影响,重组tPA蛋白包涵体经尿素变性溶解后,在精氨酸、精氨酸盐酸盐、半胱氨酸、胱氨酸存在的条件下进行复性,结果表明,碱性的精氨酸在质量分数0.2%时可减少蛋白质凝聚,显著提高复性效果,tPA复性后的活性可提高50%以上,半胱氨酸单独使用具有类似β-巯基乙醇的作用,精氨酸盐酸盐和胱氨酸单独使用对复性无影响,而半胱氨酸和胱氨酸联合使用,有类似氧化-还原系统作用。可提高活性20%。     

幽门螺杆菌VacA重组蛋白表达、纯化及鉴定

目的研究幽门螺杆菌空泡毒素（VacA）编码基因在大肠埃希菌中的表达及纯化重组蛋白的抗原性。方法将PET32a-vacA-E.coli BE21（DE3）工程菌株常规培养,碱裂解法小量提取重组质粒DNA,琼脂糖凝胶电泳进行酶切鉴定,基因测序法进行插入基因序列分析。重组蛋白采用IPTG诱导表达,镍亲和层析原理提纯,ELISA法检测其抗原性。结果经酶切鉴定表明,插入的基因片段全长约2240bp,测序分析及与Genebank比较,可以肯定插入片段为vacA基因,ELISA法检测重组蛋白具有良好的抗原性。结论VacA重组蛋白在大肠埃希菌中成功表达,重组蛋白具有良好的抗原性。     

GOLPH2的原核表达、纯化、抗体制备和初步应用

目前发现GOLPH2蛋白与肝癌密切相关,将golph2基因进行克隆、表达并制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.应用RT-PCR技术,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增得到golph2 cDNA,将其克隆到原核表达载体pET21a(+)-TRX内、转化大肠杆菌DH5a,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.His-tag磁珠纯化试剂盒纯化重组蛋白GOLPH2,SDS-PAGE鉴定.将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA、Western blot方法检测抗体的灵敏度和特异性,并测定临床血清标本中GOLPH2蛋白水平.成功地构建了表达TRX-GOLPH2融合蛋白的原核表达质粒pET21a(+)-TRX-GOLPH2.并在大肠杆菌BL21(DE3)内得以高效表达,且以可溶性的形式存在.SDS-PAGE和Western blot证实,重组GOLPH2蛋白质与预期结果一致.抗血清能够特异地识别52 kD重组蛋白、73 kD细胞裂解液和血清蛋白质.成功制备了GOLPH2蛋白质和多克隆抗体,能用于后续研究.     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3.1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1-egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45%,瞬时转染pcDNA3.1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用DNA重组技术,将目的基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack—CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5a;筛选出重组质粒pAdTrack—CMV—HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pad—HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad—HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT—PCR、Western印迹鉴定外源基因HAX1的表达。BrdU检测感染了Ad—HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况。结果pAdTrack—CMV—HAX1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—HAX1质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符。构建好的Ad—HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达。HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高。结论成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3.1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1-egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45%,瞬时转染pcDNA3.1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

美国、欧盟和中国生物技术药物的比较

按照相同表达系统表达的相同氨基酸序列的产品视为同种产品,而不同表达系统表达的相同氨基酸序列的产品视为不同产品的原则,归纳总结了美国、欧盟和中国已批准上市的生物技术药物。美国FDA批准的以基因工程产品、抗体工程产品和细胞工程产品为主要代表的生物技术药物共79种(18种为大肠杆菌表达,8种为酵母表达,53种为哺乳动物细胞培养生产),其中基因重组蛋白质药物为64种。欧盟批准了49种基因重组酶、激素或细胞因子,11种基因重组治疗性抗体和5种基因重组疫苗。在欧美60％-70％的产品由哺乳动物细胞表达。中国批准了27种生物技术药物。比较了美国、欧盟和中国生物制药的特点。     

片球菌素pedA基因的原核表达、纯化及生物信息学分析

旨在构建片球菌素PA-1结构基因pedA的原核表达载体,在大肠杆菌体系中实现PA-1的外源表达,运用生物信息学手段分析重组蛋白的理化性质及分子结构。以戊糖片球菌C-2-1的DNA为模板,扩增pedA基因,扩增产物克隆入pET28a(+)原核表达载体,构建pET28a-ped A重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3)中;30℃,以1 mmol/L IPTG诱导表达5 h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,检测纯化后重组蛋白的抑菌活性;利用生物信息学手段探究重组蛋白的理化性质及分子结构信息。结果显示,pET28a-ped A重组质粒构建成功,带有His标签的PA-1重组片球菌素在大肠杆菌中实现了可溶性表达,利用Ni-NTA亲和层析获得纯化的重组蛋白,Tricine-SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的重组蛋白分子量约为7.8 k D,与理论值相符。琼脂扩散法抑菌活性实验抑菌圈效果明显,表明纯化的重组片球菌素具有抑菌活性。生物信息学方法对比分析其蛋白结构发现,获得的重组蛋白含有信号肽,α螺旋占23.53%,疏水性提高,可能促进了重组蛋白的可溶性表达。该实验成功构建了片球菌素PA-1的原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的可溶性表达,该表达可能与其含有信号肽及信号肽疏水性有关,纯化后的重组蛋白抑菌活性明显。