苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3A在鳞翅目特异菌株中的？…

将对鞘翅目昆虫有特异毒性的苏云芽孢杆菌ｃｒｙ３Ａ基因电转化到只对鳞翅目昆虫有毒性的苏云金芽孢杆菌野隆型菌株ＹＢＴ８０３－１中,获得转了ＢＭＢＹ－００１。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析及镜检结果表明,ｃｒｙ３Ａ基因可在该菌株中高效表达,但出发菌株中原有的ｃｙｒ１Ａｂ、ｃｒｙ１Ａｃ及ｃｒｙ２的表达则受到不同程度的影响。生物测定结果显示,转子ＢＭＢＹ－００１对柳蓝叶甲（鞘翅目）具有较高毒力,ＬＣ５０为０．４１３μ     

苏云金芽孢杆菌B-Pr-88菌株中cry2Ab4基因的表达和杀虫活性研究

以我室自行分离的对鳞翅目夜蛾科害虫具有高毒力的Bt菌株B-Pr-88为材料,用PCR-RFLP方法从其质粒DNA文库中筛选到含cry2Ab基因的一个阳性克隆pZF858,序列测定发现,该片段含有cry2Ab全长基因,开放读码框为1902bps,编码由633个氨基酸组成的70.7kD蛋白,氨基酸同源性与已公布的cry2Ab基因同源性均为99.8%,经Bt基因国际命名委员会正式命名为cry2Ab4。根据cry2Ab4基因开放阅读框架(ORF)两端序列,设计合成一对特异引物L2ab5和L2ab3,PCR扩增获得cry2Ab4完整ORF,与大肠杆菌表达载体pET-21b连接,构建了重组表达质粒pET-2Ab4,质粒导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳证实该基因表达了60kD的蛋白,生物测定表明,Cry2Ab4对棉铃虫和大豆食心虫具有高毒力,同时对小菜蛾和二化螟有一定的杀虫活性,而对亚洲玉米螟和甜菜夜蛾没有杀虫活性。     

苏云金芽孢杆菌cry基因研究进展

从cry基因的分类、cry基因与转座因子的关系、cry基因的表达调控以及cry基因的作用机理等 4个方面综述了cry基因的研究进展 ,并简要展望了其研究和应用前景。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白超量表达的机制

杀虫晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌主要杀虫成分,进一步提高杀虫晶体蛋白的表达量是苏云金芽杆菌高效工程菌构建的主要途径。本文讨论了ｃｒｙ基因启动子活性、ｍＲＮＡ稳定性、不同ｃｒｙ基因间的协同表达发及伴了孢晶体的形成等几个方面在转录水平或转录后水平上对杀虫晶体蛋白表达的影响。     

苏云金芽孢杆菌cry1Ab13基因的克隆及表达研究

BtC0 0 5是我国自行分离的对多种害虫具有毒杀作用的苏云金芽孢杆菌 ,经PCR RFLP系统鉴定 ,它含有cry1Ab基因。Southernblot结果显示 :PstI酶切C0 0 5质粒所得的 8 5kb长的DNA片段为cry1Ab基因的阳性杂交带。以pUCP1 9为载体 ,克隆了该片段并证明其含有cry1Ab基因。对其进行亚克隆和测序 ,结果表明该基因编码区为 3 4 6 8bp ,其编码的蛋白含1 1 5 5个氨基酸 ,分子量为 1 3 0 6kD ,等电点为pH4 845。该基因已在GenBank基因库中注册 ,Accessionnumber为AF2 5 4 6 4 0 ,并为国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Ab1 3。将cry1Ab1 3基因在Bt无晶体突变株cryB- 中表达 ,蛋白质电泳结果表明在 1 3 0kD处有表达带 ,并证明CryAb对小菜蛾有较高的杀虫活性。     

苏云金芽孢杆菌4.0718菌株的杀虫晶体蛋白基因分析

根据苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)cry1、cry2和cry3型基因的保守区分别设计了3对通用引物Un1(d)/Un1?、Un2(d)/Un2?和Un3(d)/Un3?,以Bt4.0718菌株质粒DNA为模板进行PCR扩增,通过扩增产物片段的分子量大小来确定该菌株所含有的杀虫晶体蛋白基因类型。随后根据上述3类cry基因的高变区设计特异引物再次进行PCR鉴定。结果表明:Bt4.0718菌株含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Cb、cry2Ac和新基因cry4.5等6种基因类型。这一结果为利用该菌株构建高效广谱杀虫工程菌提供了客观依据。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基cry3A在鳞翅目特异菌株中的表达及杀虫特性

将对鞘翅目昆虫有特异毒性的苏云金芽孢杆菌cry3A基因电转化到只对鳞翅目昆虫有毒性的苏云金芽孢杆菌野生型菌株YBT803-1中,获得转化了BMBY-001。SDS-PAGE分析及镜检结果表明,cry3A基因可在该菌株中高效表达,但出发菌株中原有的cry1Ab、cry1Ac及cry2的表达则受到不同程度的影响。生物测定结果显示,转化子BMBY-001对柳蓝叶甲(鞘翅目)具有较高毒力,LC50为0.413μL／mL(浸叶法),对小菜蛾(鳞翅目)的毒力比野生受体菌YBT803-1有所降低,LC50值为3.319μL／mL。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3A在鳞翅目特异菌株中的表达及杀虫特性

将对鞘翅目昆虫有特异毒性的苏云金芽孢杆菌cry3A基因电转化到只对鳞翅目昆虫有毒性的苏云金芽孢杆菌野生型菌株YBT8031中,获得转化了BMBY001。SDSPAGE分析及镜检结果表明,cry3A基因可在该菌株中高效表达,但出发菌株中原有的cry1Ab、cry1Ac及cry2的表达则受到不同程度的影响。生物测定结果显示,转化子BMBY001对柳蓝叶甲(鞘翅目)具有较高毒力,LC50为0413μL/mL(浸叶法),对小菜蛾(鳞翅目)的毒力比野生受体菌YBT8031有所降低,LC50值为3319μL/mL。     

苏云金杆菌cry 1C基因检测及其与杀虫活性的关系

对实验室分离保存的 5 4株苏云金芽孢杆菌的H 血清型、杀虫晶体蛋白质 ,杀虫基因cry 1C和对甜菜夜蛾的活性进行了检测 ,分析了它们之间的关系。结果表明 ,有 2 8株菌株含有cry 1C基因 ,携带有cry 1C基因的菌株的晶体蛋白质主要为 135ku左右 ,它们对甜菜夜蛾均有较高的毒性 ,这些菌株的鞭毛抗原血清型主要分布在H 5和H 7。     

苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因克隆及油菜叶绿体遗传转化研究

向细胞核导入外源基因的核转化技术是植物基因工程的主要方法。然而,外源基因表达效率低,表达不稳定,基因易失活和因随机插入而造成的位置效应等是该方法不足之处。而且,由于外源基因可随花粉扩散,细胞核转化体的生物安全性问题已在全球范围内引起世人的关注和担忧。将外源基因导入叶绿体基因组有望克服细胞核转化中存在的某些弊端。油菜作为世界上重要的油料作物,其叶绿体遗传转化研究还未见报道。本研究从苏云金芽孢杆菌克隆得到野生型杀虫晶体蛋白基因,构建了用于油菜叶绿体定点转化的植物表达载体,并用基因枪法将杀虫蛋白基因导入油菜,…     

苏云金芽孢杆菌菌株YBT1535转cry1C基因菌的构建

利用电脉冲将ｃｒｙ１Ｃ基因转子苏云金孢杆菌野生菌株ＹＢＴ１５３５,筛选得到３个转化子。质粒电泳、ＰＣＲ扩增及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果均证明,基因ｃｒｙ１Ｃ已转入菌株ＹＢＴ１５３５。生物测定结果表明,３个转化子对甜菜夜蛾的毒力比出发菌ＹＢＴ１５３５均有显著的提高,转化子ＹＢＴ１５３５－１和ＹＢＴ１５３５－３对小菜蛾和棉铃虫的生物活性与出发菌ＹＢＴ１５３５相近,而转子化子ＹＢＴ１５３５－２则有一定幅度     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab16的克隆及表达

通过对已知cry1类基因以及已发表的cry1Ab的序列进行分析,分别设计了引物P1、P2、P3和P4,首次从无晶体的芽胞杆菌AC11中扩增到一个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein, ICP）cry1Ab类基因。测序结果显示该基因与已知的cry1Ab1基因有8个核苷酸不同,编码的蛋白有7个氨基酸差异。此基因已登录GenBank,并命名为新亚型基因cry1Ab16 (Ac. NO. AF375608)。Southern杂交结果进一步证实该基因存在于菌体的质粒上。将cry1Ab16基因克隆到Escherichia coli表达载体pQE30上并转化E. coli M15。Western印迹分析表明,E. coli M15表达了130 kD的Cry1Ab16蛋白,但此蛋白不稳定,大部分降解成65 kD的蛋白。将表达Cry1Ab16 蛋白的大肠杆菌用涂布法对三龄小菜蛾（Plutella xylostella）毒力测定,其LC50为258.3mg/L;对其他夜蛾科害虫的生长发育也有明显的抑制作用。     

Bt菌株QCL-1中cry2Ac10基因的克隆、表达和活性研究

目的:从高毒力Bt菌株中克隆cry2Ac10基因,并研究其表达和杀虫活性。方法:以Bt菌株QCL-1质粒为模板,利用cry2特异性引物FY2A5和FY2A3进行PCR扩增,将目的片段克隆到表达载体pET-21b( ),构建T7启动子控制的大肠杆菌重组表达质粒pET21b-cry2Ac。经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测基因表达情况,然后对表达产物进行生物活性测定。结果:从菌株QCL-1中克隆出目的基因,该基因的编码框由1 872个碱基组成,编码的蛋白质由623个氨基酸组成,与已报道的Cry2Ac氨基酸同源性为97.4%~99.7%。该基因(GenBank accession EF405952)已被国际Bt基因命名委员会正式命名为cry2Ac10。该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达70kDa的蛋白,表达产物对棉铃虫、粘虫和粉纹夜蛾幼虫具有高毒力,同时对甜菜夜蛾幼虫生长有抑制作用,其中对棉铃虫和粘虫初孵幼虫的LC50分别为30.0μg/g和16.7μg/g。结论:成功克隆和表达了cry2Ac10基因,并明确了cry2Ac10蛋白的活性,为该基因的研究和应用奠定基础。     

Bt4.0718 cry1Ac基因的克隆与表达分析

在基因库中比对14种cry1Ac基因序列,发现了同源性很高的上游启动子区域和下游终止子区域。根据这一同源序列设计引物,从B t4.0718中扩增出包含双启动子和终止子的4.2 kb片段,用PCR-RFLP检测确定其中含有cry1Ac基因。然后将此片段克隆到穿梭载体pHT304中,转化大肠杆菌DH5α和B t无晶体突变株XZM-101。同时,利用原子力显微镜观察发现重组菌株BXZM34能够产生菱形晶体。     

B.thuringiensis穿梭载体的构建及cry1C基因的表达

以ＵＣ１９为母体,克隆了Ｂｔ ｋｅｎ－Ａｇ（Ｂ。．ｔｈｒｕｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｋｅｎｙａｅ Ａｇ）的复制起始区（～１．６ｋｂ）、ｐＵＣ４Ｋ的ａｐｈ１基因,构建成穿梭载体ｐＨＶ－１,ｐＨＶ－１在Ｅ．ｃｏｌｉ中经１００个世代,质粒保持率在８０％以Ｂｔｉ ４Ｑ８（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ ４Ｑ８）中经４０个世代,质粒保持率在８０％以上,将Ｂ．ｌｉｃｈ     

一种新的Bt杀虫基因HJC原核表达蛋白活性的鉴定

HJC基因是由2个Bt基因(cry1Ab和vip3)经过人工融合而成,具有更广谱的杀虫活性,可延缓害虫产生交互抗性的时间。将已构建好的携带HJC基因的重组质粒pET28a-HJC转化到大肠杆菌BL21中诱导表达。该HJC融合蛋白主要以包涵体形式存在,变性条件下使用镍亲和层析柱对其进行纯化,并经尿素梯度透析复性后,进行免疫反应活性及美国白蛾杀虫活性测定。Western blot结果显示,该原核表达蛋白与转HJC基因水稻中的HJC蛋白有相同的免疫反应性,对美国白蛾也有一定的杀虫活性,可以替代植物外源蛋白进行转HJC基因产品的食用安全性评价。