CRISPR/Cas系统的研究进展及前沿应用

CRISPR/Cas系统作为一种高效的基因组编辑工具,已经被广泛地研究和应用于各个领域。CRISPR/Cas系统已从最初的CRISPR/Cas9发展到现在的CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13a、CRISPR/dCas等十多种基因编辑系统;从原来的靶向作用于DNA到现在的除了靶向作用于DNA和RNA外,还能应用于转录调控、DNA循环等无需基因编辑的领域。CRISPR/Cas系统以往存在的诸多局限性正在被一个一个突破,该系统的应用已经进入了一个新的时代。本文对CRISPR/Cas系统近些年的发展情况以及新发现的各种CRISPR/Cas系统做了一个总结,并列举了各个系统最新的应用情况。     

基因组工程在医学合成生物学中的应用

合成生物学旨在建立一套完整的工程理论和方法,通过设计和组装基本生物学元件,更为有效地实现复杂生物系统的设计,并使其完成可编程的生物学功能。近年来随着可编程基因组元件的出现,特别是CRISPR和CRISPRi技术平台的建立和完善,使得合成生物学进入了一个全新发展的时期。本文重点综述CRISPR等基因组编辑和调控技术,其在构建可编程生物学元件和复杂基因线路的应用以及合成生物学在医学中(称为医学合成生物学)的发展前景。     

植物CRISPR基因组编辑技术的新进展

在过去的4年中,CRISPR/Cas9基因组编辑技术成为生命科学领域的革命性工具,为植物学基础研究和农作物遗传改良提供了高效、快速而又廉价的遗传操作工具。利用CRISPR/Cas9系统可以实现精准的knock-out和knock-in等遗传操作,也可用于靶向激活或抑制基因的表达。在CRISPR/Cas9被广泛地用于基因组编辑的同时,它的编辑能力、效率和精确度也在不断地改进和完善,特别是CRISPR/Cpf1系统的发掘和单碱基编辑技术的创建,使CRISPR系统正逐步成为一个理想的遗传工程技术平台。此外,利用CRISPR/Cas9技术改良的农作物品种也已经涌现,这必将推动精准基因组编辑技术在农作物遗传改良中的应用和发展。     

多靶点CRISPR表达载体系统的设计和构建

CRISPR/Cas9核酸酶系统能实现多基因的高效靶向编辑,但是多靶点CRISPR表达载体的构建比较复杂。本研究以细菌的DNA旋转酶和二氢叶酸还原酶为靶基因,选择多个打靶位点,合成携带靶序列和多克隆位点的寡聚核苷酸引物,直接退火延伸合成靶序列DNA,利用同尾酶产生相同粘性末端的特点,将靶序列克隆至骨架载体,然后依次加入更多靶序列,实现多靶点的串联。最后测序验证,单靶点、双靶点和三靶点成功插入CRISPR表达载体,同时保留了多克隆位点,实现多靶点串联。本研究设计的多靶点CRISPR表达载体系统操作简单、成本低、成功率高,为后续细菌多基因编辑提供技术支撑,同时可拓展应用于其他生物多基因打靶研究。     

基于CRISPR/Cas系统的多重基因编辑与调控技术

规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及其相关Cas蛋白所构建的CRISPR/Cas系统是古细菌或细菌中特有的一种获得性免疫系统。研究人员将其开发成基因编辑工具之后,凭借其高效、精准和通用性强等优点迅速成为合成生物学领域的热门研究方向,在生命科学、生物工程技术、食品科学及农作物育种等多个领域引发了革命性的影响。目前基于CRISPR/Cas系统单基因编辑与调控技术日益完善,但在多重基因编辑和调控方面仍存在挑战。本文聚焦基于CRISPR/Cas系统的多重基因编辑与调控技术开发及应用,针对单个细胞内实现多位点基因编辑或调控和细胞群体内实现多位点基因编辑或调控技术,依据作用原理对其进行了系统总结和阐述,包括基于CRISPR/Cas系统的双链断裂、单链断裂以及多重基因调控技术等。这些工作丰富了多重基因编辑与调控的工具,为CRISPR/Cas系统在多领域的应用作出了贡献。     

CRISPR/Cas9系统在临床医学研究的应用与改进

癌症与遗传疾病等难治性疾病的发生发展一般是多因素协同的结果，涉及复杂的信号网络及多生物分子的相互作用。了解其中驱动的关键元素有助于为临床上的治疗和研究打开新的突破口。然而，探究驱动元素用于难治性疾病治疗的挑战之一是缺乏方便、可编程的基因编辑工具。近年来，新型的CRISPR/Cas9系统由于其组分简单、基因编辑效率高等特点逐渐成为临床医学研究中应用最为广泛的基因编辑工具。本文介绍了CRISPR系统应用于临床研究中的相应进展和潜在挑战。阐述了基于CRISPR系统sgRNA序列重构能改变靶向性及系统本身的可编程性等特性，其可在进行适当的改造和修饰后实现对活细胞染色体的实时成像，用以了解生物体在面临外界刺激时基因组的时空调节。评估了CRISPR系统在基因筛选、免疫治疗和遗传疾病治疗方面的重大价值，尤其是CRISPR系统进行相应改造后系统用在临床研究中安全性与功能性的提升。介绍了CRISPR系统在临床研究中的应用障碍、局限以及对其相应的优化改造，展望CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用前景及其在临床医学领域的发展优势，以期能为CRISPR系统的进一步应用与优化提供参考。     

基因编辑技术研究进展及其在苜蓿等豆科饲草作物中的应用

基因编辑是对生物基因组进行靶向修饰的一项新型生物技术,可以在不同物种中实现对目标基因的定点敲除、基因片段置换以及基因定点插入等基因定向编辑,目前基因编辑技术已在植物基因功能解析和作物遗传改良研究中得到广泛应用。本文简要回顾基因编辑技术的发展历程,重点介绍新近发展的CRISPR/Cas9技术在植物中的研究进展,并对CRISPR/Cas基因编辑技术在苜蓿等饲草作物中的应用进行探讨和展望。     

运用CRISPR/Cas9技术敲除人源黏着斑蛋白基因

目的:建立CRISPR/Cas9n系统,用于敲除人源黏着斑蛋白(VCL)基因。方法:设计一个靶向人源VCL基因第3个外显子的单向导RNA(sgRNA),分别克隆表达载体后,通过慢病毒转入人MDA-MB-231细胞,通过PCR及Western印迹检测细胞株中VCL基因的敲除效果。结果:测序结果显示靶向VCL基因CRISPR/Cas9重组质粒构建成功;PCR产物测序结果表明本次设计的Cas9/sgRNA能够对VCL基因进行编辑敲除;Western印迹显示Cas9-VCL组的MDA-MB-231细胞内VCL表达水平较对照组显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向VCL基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除VCL。     

CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中技术改进与创新的研究进展

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是一项对基因组进行精准修饰的技术,可实现对靶标基因的碱基插入、缺失或DNA片段替换。随着人们对CRISPR/Cas9系统的了解逐渐加深,其在科研、农业和医疗等领域的应用也越来越广泛。该文简要介绍了CRISPR/Cas9基因组编辑技术的发展以及工作原理,总结了近几年对该技术进行优化与改进的研究进展,包括基因组编辑效率的提升、基因组编辑范围的扩展、单碱基精准编辑以及多基因同时编辑、基因组编辑安全性的提升以及基因片段替换与基因靶向转录调控,以期为深入开展这一领域的研究提供参考。     

CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中技术改进与创新的研究进展

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是一项对基因组进行精准修饰的技术, 可实现对靶标基因的碱基插入、缺失或DNA片段替换。随着人们对CRISPR/Cas9系统的了解逐渐加深, 其在科研、农业和医疗等领域的应用也越来越广泛。该文简要介绍了CRISPR/Cas9基因组编辑技术的发展以及工作原理, 总结了近几年对该技术进行优化与改进的研究进展, 包括基因组编辑效率的提升、基因组编辑范围的扩展、单碱基精准编辑以及多基因同时编辑、基因组编辑安全性的提升以及基因片段替换与基因靶向转录调控, 以期为深入开展这一领域的研究提供参考。     

CRISPR/Cas基因组编辑技术及其在神经退行性疾病中的应用研究进展

CRISPR/Cas系统实质上是一系列由RNA引导的核酸内切酶,其存在于约40%的细菌和90%的古细菌中,是细菌或古细菌为抵抗病毒或质粒而演化出的一种获得性免疫,主要作用是沉默入侵的外源核酸。近年来,CRISPR/Cas系统凭借其简单、高效且可编辑的靶向基因修饰能力,开启了基因编辑的新纪元。神经退行性疾病一直是困扰人类的重大疾病,而CRISPR/Cas系统的出现为治疗神经退行性疾病提供了新的思路和方法,现介绍CRISPR/Cas系统基因编辑的机制及其在神经退行性疾病中的应用。     

家蚕CRISPR/Cpf1基因编辑系统建立

自CRISPR/Cas9基因编辑系统成功应用于模式生物以来,因其快速、高效、便捷等特点,广泛应用于基因功能研究、基因治疗和基因工程等研究领域。与此同时,CRISPR/Cas系统不断在微生物界的发现也加速了新的基因编辑工具的不断涌现。CRISPR/Cpf1是第二类 (Ⅴ型) 能够编辑哺乳动物基因组的CRISPR系统,相比于CRISPR/Cas9基因编辑系统,能够利用5′T-PAM富集区增加基因组覆盖率,具有其切割位点为粘性末端和更不易同源重组修复等诸多优势。基于此,本研究构建了能够在家蚕细胞表达的3个不同来源的CRISPR/Cpf1 (AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1) 表达载体,选择高度保守的家蚕热休克蛋白基因BmHSP60和家蚕ATP酶家族BmATAD3A基因分别设计靶标gRNA,构建gHSP60-266R和gATAD3A-346R基因编辑载体。通过T7E1酶切分析和T克隆测序,鉴定3个Cpf1基因编辑系统AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1对靶标基因BmHSP60和BmATAD3A的编辑效率。同时,利用Western blotting分析不同基因编辑系统敲除靶基因后对其BmATAD3A和BmHSP60蛋白翻译的影响。本研究成功构建了家蚕CRISPR/Cpf1基因编辑系统,能够在家蚕细胞中有效编辑家蚕基因组,为家蚕基因功能研究、基因工程和遗传育种开发了新技术与新方法。     

烟草香气相关基因CRISPR/Cas9编辑突变体库的构建

为探究CRISPR/Cas9基因编辑技术构建烟草突变体库的可行性,该研究以烤烟品种‘红花大金元''为实验材料筛选了100个可能参与烟草香气代谢的基因,设计相应的100个sgRNA并构建了由100个CRISPR/Cas9编辑载体组成的质粒库,获得转基因材料后分析了载体的共转化率、靶向编辑率和脱靶编辑情况。结果表明:(1)通过农杆菌介导100个sgRNA的共转化后,在172个阳性转化株中检测到了其中的77个sgRNA,共转化率为77%。(2)在77个携带sgRNA的转基因后代中,69个sgRNA对目标基因进行了靶向编辑,编辑率为89.6%。(3)脱靶位点测序检测发现,只有1个sgRNA在非目标靶位点产生了脱靶编辑,表明CRISPR/Cas9基因编辑技术在烟草中的脱靶概率非常低。综上所述,利用CRISPR/Cas9载体库共转化对烟草基因进行高通量靶向编辑以构建突变体库的方法切实可行,并且该方法有共转化率高、编辑率高和脱靶编辑概率低等特点。     

CRISPR/Cas工具——分子遗传研究的新刃

遗传与变异体现着生命之美和生命之奥妙,前人在不断探求的过程中逐渐形成了严谨的体系和科学的方法——遗传学。在遗传学的研究中基因编辑工具的作用是不可或缺的,近年来发现的CRISPR/Cas系统作为基因编辑工具箱中的新刃,以其特异性强、靶向性好、适用性广的特点迅速成为广大科研工作者研究和开发的热点。并且,在探索生命暗物质的过程中,会有更多的新的CRISPR/Cas系统被发现并应用在遗传研究等领域。为此,本文综述目前CRISPR/Cas系统的最新研究进展,力图从其系统多样性、分子工作机制及遗传研究应用等方面,为广大科研工作者提供一个系统了解CRISPR/Cas系统及其研究现状的窗口,以期为该领域的研究与应用提供一些有益的参考。     

CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段编辑中的应用

源于细菌和古菌的Ⅱ型成簇规律间隔短回文重复系统[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated nuclease 9 (Cas9),CRISPR/Cas9]近年被改造成为基因组定点编辑的新技术。由于它具有设计简单、操作方便、费用低廉等巨大优势,给遗传操作领域带来了一场革命性的改变。本文重点介绍了CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段靶向编辑方面的研究和应用,主要包括DNA片段的删除、反转、重复、插入和易位,这一有效的DNA片段编辑方法为研究基因功能、调控元件、组织发育和疾病发生发展提供了有力手段。本文最后展望了Ⅱ型CRISPR/Cas9系统的应用前景和其他类型CRISPR系统的应用潜力,为开展利用基因组DNA片段靶向编辑进行基因调控和功能研究提供参考。     

快速构建CRISPR/Cas9基因组靶向编辑系统

CRISPR/Cas9核酸酶作为一种新的基因组靶向编辑技术,已成功应用于多种动植物基因组修饰研究. CRISPR/Cas9作用后的阳性细胞筛选和富集是该技术的关键之一. 本研究以鸡EAV-HP（endogenous avian retrovirus-HP）基因和MSTN（myostatin）基因为例,从靶位点的选择、表达载体构建、双基因报告载体构建和核酸酶活性验证4个方面,系统研究了CRISPR/Cas9核酸酶技术平台. 结果表明,利用寡聚核苷酸直接退火方法,构建表达载体和报告载体的阳性率分别高达100%和89.5%. 报告载体的PuroR（puromycin resistant gene）和eGFP（enhanced green fluorescent protein）基因的成功表达表明,构建的CRISPR/Cas9系统能有效切割靶序列,并用于后续阳性克隆的筛选和富集. 本方法摒弃了传统分子克隆的PCR扩增和酶切处理目标基因的方法,而是利用寡聚核苷酸直接退火获得含有黏性末端的目标DNA,简化了载体构建过程,低成本且快速获得CRISPR/Cas9基因组靶向编辑系统.     

CRISPR/Cas9技术在生物医学领域的非病毒及病毒载体

规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)及CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统是一种新型基因组编辑技术,能够靶向干扰或修复基因组的特定基因.来自细菌或人工改造的CRISPR/Cas9系统已经由生物学家发现或构建,Cas9核酸酶及单链导向RNA(sgRNA)是CRISPR/Cas9系统的主要组成成分.该系统被广泛应用于疾病治疗新靶点的发掘,基因功能的鉴定,动物模型的建立以及基因治疗药物的开发.CRISPR/Cas9系统已经通过突变或修正疾病相关基因来部分缓解或彻底治愈某些病症.然而,如何有效递送CRISPR/Cas9至目标细胞及靶器官仍然是运用该技术所面临的挑战之一,这影响着该系统稳定和精准的基因编辑能力.本文主要综述Cas9mRNA,Cas9蛋白或编码Cas9基因及相应sgRNA载体的递送系统.递送Cas9蛋白的非病毒载体能够维持Cas9的靶向作用,减少脱靶效应;递送sgRNA和供体模板的病毒载体能够改进基因编辑及同源修复效率.安全,有效及可规模化生产的递送载体将会推进CRISPR/Cas9技术在人类基因治疗领域中的应用.     

CRISPR/Cas9在放线菌合成生物学研究中的应用和发展

放线菌是活性天然产物和抗生素药物的重要来源。利用合成生物学高效地开发其中丰富的天然产物资源,将为加速新药开发奠定坚实的基础。CRISPR/Cas9作为一种多功能基因编辑系统,因其便捷高效而被广泛应用于真核生物的遗传操作。但在原核生物尤其是放线菌中的应用仍处于起步阶段,机遇和挑战并存。本综述总结了目前CRISPR/Cas9系统在放线菌基因编辑和调控,以及活性天然产物的产量提升、生物合成机制解析和资源开发等方面的研究进展。同时,也对该系统在应用中面临的包括重组修复效率低,以及靶向切割效率不足等关键挑战进行了分析,并提出了相应的优化解决方法。随着CRISPR/Cas9在放线菌应用中的不断完善和发展,将极大地推动放线菌的合成生物学研究,促进其中天然产物资源的有效挖掘和应用开发。     

基于CRISPR/Cas系统的基因编辑工具及其改进策略

CRISPR/Cas系统自发现以来持续推动着生命科学领域的进步。与此同时,CRISPR/Cas介导的基因编辑技术也在不断发展壮大。基于DSBs修复的CRISPR/Cas基因编辑技术、碱基编辑器和先导编辑器等新型基因编辑工具的开发为生物学基础研究铺平了道路。虽然这些工具为生物技术带来了革命性变化,但基因编辑效率偏低、产物纯度不高、脱靶效应频繁等问题也随之而来。不断开发精确、高效和安全的CRISPR/Cas基因编辑工具仍是当前和未来的生命科学研究热点。概述了CRISPR/Cas基因编辑工具的发展、构成及原理,总结了CRISPR/Cas基因编辑系统提升编辑效率、扩展编辑范围和降低脱靶效应的通用策略及不同CRISPR/Cas基因编辑工具的改进方法,并就CRISPR/Cas基因编辑工具未来的研究方向进行展望。