基于质谱技术的蛋白质互作研究进展

蛋白质作为生命活动的执行者,其功能往往体现在与其他蛋白质的相互作用中,研究蛋白-蛋白相互作用对于人们深入了解和预防传染病、靶向治疗多基因疾病、阐明蛋白质的分子作用机制及各种复杂的生命现象具有重要意义。目前,有多种技术被用来研究蛋白间的相互作用,研究难点在于实时捕获瞬时或弱蛋白质间的相互作用,质谱技术（mass spectrometry, MS）可在某种程度上解决该难点。由于质谱技术可研究简单的蛋白质复合物再到大规模的蛋白质组实验,基于质谱技术研究蛋白质间相互作用被越来越多地应用于科学研究中。综述了蛋白质间相互作用检测方法的研究进展,重点介绍了氢氘交换质谱法和化学交联质谱法研究蛋白质间相互作用的优缺点及其应用,最后对基于质谱技术研究蛋白质间相互作用进行了总结与展望,以期为深入开展相关研究提供借鉴。     

胃癌相关新蛋白Raf激酶抑制蛋白相互作用蛋白质的鉴定

Raf激酶抑制蛋白(RKIP)的异常表达在胃癌的发生发展中起重要的作用,为了阐明其作用机制,应用脂质体将RKIP-3xFLAG-pcDNA3.1质粒转染至SGC7901细胞,建立RKIP-3xFLAG高表达的SGC7901细胞;并利用3xFLAG标签的亲和层析技术联合质谱分析,分离、鉴定与RKIP相互作用的蛋白质,并应用免疫共沉淀联合Western-blot进一步验证质谱结果．共鉴定出66个RKIP相互作用蛋白质,功能分类包括蛋白质代谢酶类、生物氧化相关酶类,细胞骨架蛋白、分子伴侣、信号转导相关蛋白、酶解相关蛋白等．并首次证实14-3-3蛋白与RKIP存在相互作用．为阐明RKIP在胃癌发生发展中的作用机制提供了重要的线索,为胃癌的早期诊治及预后监测提供了新的靶点．     

蛋白片段互补分析方法及其应用北大核心CSCD

蛋白片段互补分析技术是近年发展起来的一种分析蛋白质-蛋白质相互作用的新方法。典型的蛋白片段互补分析技术已经成功地利用二氢叶酸还原酶,β-内酰胺酶,绿色荧光蛋白以及荧光素酶片段互补进行胞内蛋白分子相互作用研究。这一技术不仅可以动态、定位分析细胞内蛋白质分子相互作用、绘制细胞内信号传导、蛋白质生物化学网络,还可以应用到蛋白质文库、cDNA文库和高通量药物筛选等。综述了蛋白片段互补分析技术的原理、方法及其应用。     

双杂交和质谱技术在蛋白质-蛋白质相互作用研究中的应用

基因的功能是由蛋白质来执行的,而蛋白质要通过与其他生物分子相互作用来完成其各种生物功能。因此,如果能够快速做出蛋白质在不同时间、空间和不同环境中的相互作用图谱,就会帮助我们了解这些蛋白质的功能,进而了解许多生命活动的机制。目前,用于大规模研究蛋白质间相互作用的方法主要有酵母双杂交系统及其衍生系统、亲和纯化与质谱分析联用技术,前者用于研究蛋白分子间的两两相互作用,后者用于研究蛋白质复合物间的相互作用。本文主要阐述了酵母双杂交、细菌双杂交、哺乳动物细胞双杂交、亲和纯化与质谱联用技术在大规模蛋白质相互作用研究中的应用。     

功能蛋白微阵列的作用

对蛋白质阵列的两大功能—分子识别和酶活测定进行了阐述.其中前者包括蛋白质-D N A间的相互作用、蛋白质-蛋白质复合体的相互作用、蛋白质-小分子之间的相互作用;后者包括阵列蛋白作为底物来测酶活、阵列蛋白作为酶的酶活.     

蛋白质结构与相互作用研究新方法——交联质谱技术

蛋白质的空间结构信息以及蛋白质间的相互作用信息对于研究蛋白质的功能有重要意义.研究蛋白质结构与相互作用的传统技术,如核磁共振技术、X射线晶体衍射技术等,对于蛋白质的纯度、结晶性和绝对量均有比较高的要求,限制了其广泛应用.交联质谱技术是近十多年来发展起来的新技术,它将质谱技术与交联技术相结合,在研究蛋白质结构与相互作用方面具有速度快、成本小、蛋白质各方面性状要求低等优势.本文就交联质谱技术各个环节的技术方法加以综述,包括交联质谱实验分离富集技术、常见交联剂特性、交联质谱数据库搜索算法、结果验证研究和交联质谱技术的应用等方面,并展望了该研究方向未来的发展.     

萤火素酶互补实验检测蛋白互作

蛋白质-蛋白质相互作用在真核生物的各项生命活动中发挥重要作用。与其它蛋白质互作研究技术相比,借助于烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时表达系统的萤火素酶互补实验(LCA)具有简单、灵敏、可靠、高效和低背景等优点,并可轻松扩展为大规模蛋白质互作的筛选和验证研究。该文介绍了萤火素酶互补实验的具体操作过程,通过2种数据收集方法来定性并定量分析生物发光或发光强度,从而检测植物目标蛋白之间的相互作用。     

萤火素酶互补实验检测蛋白互作

蛋白质-蛋白质相互作用在真核生物的各项生命活动中发挥重要作用。与其它蛋白质互作研究技术相比,借助于烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时表达系统的萤火素酶互补实验(LCA)具有简单、灵敏、可靠、高效和低背景等优点,并可轻松扩展为大规模蛋白质互作的筛选和验证研究。该文介绍了萤火素酶互补实验的具体操作过程,通过2种数据收集方法来定性并定量分析生物发光或发光强度,从而检测植物目标蛋白之间的相互作用。     

细胞培养稳定同位素标记技术在蛋白质组学中的应用与进展

细胞培养稳定同位素标记技术（SILAC）是在细胞培养过程中,利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术,对蛋白表达进行定量分析的一种新技术。它不仅可以对蛋白质进行定性分析,还可通过质谱图上一对轻-重稳定同位素峰的比例来反映对应蛋白在不同状态下的表达水平,实现对蛋白质的精确定量。SILAC结合质谱技术在定量蛋白质组学中发挥了巨大的作用,其应用范围从细胞系扩展到亚细胞器、组织与动物整体水平,具体的应用策略也在不断完善发展。我们总结评述了SILAC技术在差异表达蛋白质组、蛋白质翻译后修饰、药物蛋白质组和蛋白质相互作用等方面的应用与进展。     

乙肝病毒X与Tab1蛋白相互作用的体内外验证

目的:借助实验室前期质谱分析技术和数据分析研究基础,采用免疫共沉淀(Co-IP)和蛋白质沉降实验(GST pull-down)验证HBV X蛋白与Tab1蛋白的相互作用,为进一步研究HBx在HBV慢性感染致癌机制中的作用提供一定的实验依据。方法:成功构建pGEX-2TK-GST-HBx质粒,对GST-HBx融合蛋白进行诱导表达,与GST-beads结合孵育,构建pcDNA3.1/myc-His(-)BTab1,转染293T细胞使其表达,然后GST pull-down体外试验验证二者的相互作用;构建pcDNA3.1/myc-His(-)B-Tab1和pcDNA3.1-3×flag-HBx真核表达质粒,共转染293T和HepG2细胞使其表达,通过Co-IP实验验证抗Myc抗体可以将HBx从细胞裂解液中沉淀下来,证实了它们在两种细胞系中存在相互作用。结果:显示了HBx和Tab1在体内外条件下能够发生相互作用,为进一步明确HBV X蛋白功能及作用机制奠定基础。     

P53蛋白与SV40大T抗原之间相互作用的研究

为确定一种定量研究酵母体内蛋白质-蛋白质之间相互作用的简便、快捷的方法,为抗癌小分子化合物药物筛选提供一条可行性途径。本文选择P53蛋白与SV40大T抗原为靶蛋白对,首先用酵母双杂交系统（LiAc法质粒共转化酵母细胞）方法定性证明了两者之间存在相互作用,然后通过α-半乳糖苷酶活力定量测定了相互作用力的大小,并确定了最佳酶活测定时间,并与β-半乳糖苷酶活力测定进行了比较,认为α-关乳糖苷酶活力定量测定是研究蛋白质-蛋白质间相互作用的一种更加简便快捷的方法。     

免疫共沉淀联合质谱对肝细胞核因子3β蛋白复合体的分离鉴定

目的:利用免疫共沉淀联合质谱分析方法,在人肝癌细胞系细胞株HepG2内筛选与肝细胞核因子(HNF)3β相互作用的蛋白质。方法:通过免疫共沉淀,用特异抗体分离出HNF3β蛋白复合体,质谱鉴定其成分,NCBI数据库检索各个蛋白质的功能,分析筛选与HNF3β相互作用的蛋白质。结果:利用免疫共沉淀联合质谱分析筛选到32个与HNF3β相互作用的候选蛋白质,数据库检索发现LMNA与HNF3β具有相同功能注释,参与转录调控。结论:在细胞内HNF3β与多种蛋白质有相互作用,协同参与转录调控,推测HNF3β/LMNA之间相互作用的变化与葡萄糖及脂肪代谢及相关疾病的发生有关。     

酵母杂交系统的改进与研究进展

蛋白-蛋白相互作用在细胞生命活动中起着关键的作用。后基因组时代主要是研究蛋白的功能,通过研究蛋白的相互作用及其图谱的构建来了解蛋白的功能。研究蛋白-蛋白相互作用的方法很多,酵母杂交是最常用的检测体内蛋白-蛋白相互作用的敏感系统。随着人们对该系统的广泛应用。这一系统得到了不断的完善及改进,并广泛应用于蛋白-蛋白、蛋白质-RNA、蛋白质-DNA以及其他的小分子间相互作用的研究。拟就酵母杂交系统的原理、改进、发展及应用做一综述。     

人类14—3—3ζ和GCH1蛋白相互作用的初步研究

目的寻找人类14-3-3ζ白的相互作用蛋白,为进一步揭示14-3-3ζ的作用机理提供线索。方法以14-3—3ζ为“诱饵”,利用酵母双杂交系统筛选人脑cDNA文库得到“猎物”蛋白,通过GSTpulldown技术和哺乳动物细胞内免疫共沉淀技术验证14-3-3ζ和“猎物”蛋白的特异性结合。结果首次利用酵母双杂交cDNA文库筛选技术发现了14-3-3ζ能够与GTP环化水解酶I（GTP cyclohydrolase1,GCHl）相互作用,并通过了体内和体外的蛋白质结合实验证实了这两个蛋白质之间的特异性相互作用。结论发现并验证了14-3-3ζ与GCH1之间的蛋白质相互作用,为进一步深入研究这两种蛋白质的功能及所引起的相关疾病的发病机理提供了新的线索。     

肿瘤蛋白标志物分析技术研究进展

目前,我国的肿瘤发病率为285.91/10万,平均每分钟有6人被诊断为恶性肿瘤,因此肿瘤的早期诊断的重要性显而易见。随着分子生物学、免疫学诊断技术的飞速发展,寻找肿瘤诊断和预后的特异性标志物已成为近期研究的热点。蛋白质是生命活动中多项功能的执行者,可以直接反映基因给予的信息。相比于基因,蛋白质的表达谱更可以直接地反映功能机制。针对蛋白质的生物特性,本文总结了目前临床中筛查肿瘤蛋白标志物分析技术,如双向凝胶电泳、基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱、表面增强激光解吸/电离-飞行时间质谱、蛋白质芯片技术,并对未来肿瘤蛋白标志物筛查提出新的展望。     

人间隙连接蛋白 31 相互作用蛋白Annexin Ⅱ的筛选与证实

间隙连接蛋白 31 (connexin31 , Cx31) 是间隙连接蛋白 (connexin) 家族的一员,目前对于 Cx31 的功能及其调节方式知之甚少 . 采用固相多肽合成的方法合成 Cx31 羧基端一个多肽片段 (250~266) ,经 HPLC 纯化后偶联到匙孔血蓝蛋白,免疫新西兰雄兔后采血检测、并纯化、经蛋白质印迹、细胞免疫荧光染色、免疫沉淀证实得到的抗体为特异性抗 Cx31 的抗体 . 运用制备的抗 Cx31 多克隆抗体免疫沉淀, SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分离,蛋白质条带回收,蛋白质胶块酶解, Q-TOF 质谱分析,数据库扫描筛选可能相互作用蛋白,运用抗体 pull-down 实验,筛选到可能相互作用蛋白 annexin Ⅱ,经过免疫共沉淀、细胞免疫共定位等实验证实 annexin Ⅱ与 Cx31 相互作用 .     

生物质谱技术在蛋白质组学研究中的应用

随着技术的进步,蛋白质组学的研究重心由最初旨在鉴定细胞或组织内基因组所表达的全部蛋白质转移到从整个蛋白质组水平上阐述包括蛋白翻译后修饰、生物大分子相互作用等反映蛋白质功能的层次。多种质谱离子化技术的突破使质谱技术成为蛋白质组学研究必不可少的手段。质谱技术联合蛋白质组学多角度、深层次探索生命系统分子本质成为现阶段生命科学研究领域的主旋律之一。本文简要综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的原理、方式和应用,并对其发展前景做出展望。     

应用蛋白组方法筛选血浆中乙肝病毒PreS1结合蛋白

目的筛选血浆中乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白。方法表达纯化了PreS1-谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione—S-transferase,GST）融合蛋白,利用该蛋白与血浆进行Pull—down实验,并设立GST与血浆Pull—down,GST、PreS1-GST与PBS Pull—down对照,Pull-down产物进行双向电泳分离（2-DE）,差异蛋白点通过质谱鉴定。结果成功表达纯化出PreS1-GST融合蛋白,通过双向电泳分析发现一个PreS1特异结合蛋白,经质谱鉴定为含锚蛋白重复序列的蛋白57（ANKRD57）。结论锚蛋白重复序列的主要功能是介导蛋白质与蛋白质之间的相互作用,ANKRD57与PreS1特异结合后的生理功能值得深入研究。     

GST pull-down联合质谱鉴定BAG结构域相互作用蛋白

目的:BAG结构域(BAG domain,BD)为BAG家族蛋白的基本功能结构域,通过对BAG家族蛋白6个成员的9个BDs的相互作用蛋白进行分析,以探明不同BD相互作用蛋白的异同点并为研究BAG家族蛋白多样性生物功能的分子机制提供理论依据。方法:构建p-GEX-4T2-BDs重组子并转化E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导表达GST-BDs融合蛋白并纯化。采用GST pulldown技术联合高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的策略对BDs相互作用蛋白进行定性定量分析。最后,用DAVID(The Database for Annotation,Visualization and Intergrated Discovery)和cytoscape对BDs相互作用蛋白进行GO(Gene Ontology)功能分析及KEGG(Kyoto Enyoolpedia of Genes and Genomes)通路分析。结果:在Hela细胞的胞浆蛋白中总共鉴定到370个潜在的BDs相互作用蛋白,主要为核糖体蛋白(ribosomal proteins)、翻译起始因子(Eukaryotic translation initiation factors)、翻译延长因子(Eukaryotic translation elongation factors)、泛素化-蛋白酶体相关蛋白(ubiquitin-proteasome associated proteins)及HSP40家族蛋白。GO功能富集分析结果显示,BDs相互作用蛋白涉及多种生物学功能,包括细胞内蛋白质质量控制(protein quality control)、糖代谢(glycolysis)、免疫调控(immune response)、应激反应(stress response)、细胞周期(cell cycle)等。KEGG通路分析结果表明BDs相互作用蛋白参与多条细胞内重要的信号通路,包括FGF信号通路(FGF signaling pathway)、EGF受体信号通路(EGF receptor signaling pathway)、PDGF信号通路(PDGF signaling pathway)、Ras通路(Ras pathway)等。结论:BAG家族蛋白不同成员的BD所介导的蛋白-蛋白相互作用既有共性又有特异性,BAG家族蛋白通过BDs介导多种蛋白相互作用并参与细胞内多条重要的信号通路来调控细胞内蛋白质稳态、糖代谢、免疫反应、应激反应、细胞周期等过程。     

DNA错配修复蛋白MutS和MutL的相互作用研究

MutL 和 MutS 是DNA错配修复系统中起关键作用的修复蛋白. 利用基因融合技术高效表达了MutL 和 MutS融合蛋白,并利用它们发展了一种研究二者相互作用的简便方法. 融合蛋白MutL-GFP (Trx-His6-GFP-(Ser-Gly)6-MutL),MutL-Strep tagⅡ (Trx-His6-(Ser-Gly)6-Strep tagⅡ-(Ser-Gly)6-MutL) 和 MutS (Trx-His6-(Ser-Gly)6-MutS) 被构建并在大肠杆菌中高效表达. 收集菌体细胞、超声波破碎后离心取上清进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分析,结果表明有与预期分子质量相应的诱导表达条带出现,其表达量约占全细胞蛋白的30％且以可溶形式存在. 利用固定化金属离子配体亲和层析柱分别纯化融合蛋白,其纯度达到90％. 通过将MutS蛋白固定的方法研究两种MutL融合蛋白分别与MutS之间的相互作用. 结果表明：只有MutS蛋白与含有错配碱基DNA分子结合后才与MutL蛋白发生相互作用. 通过检测MutL融合蛋白标记的绿色荧光信号或酶学显色信号来鉴定相互作用的发生. 建立的融合分子系统方法也为研究其他的蛋白质或生物大分子之间的相互作用提供了一个技术平台.