小鼠T-bet启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

为了研究T-bet在T细胞中的转录调控机制,并研究其在多发性硬化症中的信号通路,本研究构建小鼠TBX21(编码T-bet)基因启动子区和增强子区萤火虫荧光素酶报告基因载体。在对小鼠TBX21基因5?侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从小鼠基因组中扩增出TBX21基因5?侧翼区–1 000 bp-28 bp片段长为1 028 bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1)和–3 308 bp-–2 000 bp片段长为1308 bp的非编码区保守序列(No-coding conserved sequence,CNS),再用定向克隆的方法将这两个片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10)中,构建出包含小鼠TBX21基因启动子区和CNS区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10-TBX21pr-CNS),电泳与测序鉴定,最后再将p GL4.10-TBX21pr-CNS与内参p RL-TK用lipofectamine 2000共转染293T细胞和Jurkat细胞中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定p GL4.10-TBX21pr-CNS的启动子和增强子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染p GL4.10与内参p RL-TK。结果表明,成功构建出荧光素酶报告基因重组质粒p GL4.10-TBX21pr-CNS。与转染空质粒p RL-TK组相比,293T细胞(P=0.012 2)和Jurkat细胞(P=0.002 2)中转染p GL4.10-TBX21pr-CNS组荧光素酶活性升高。研究结果表明在293T细胞和Jurkat细胞中p GL4.10-TBX21pr-CNS可以表现出启动子活性,为后续小鼠T-bet转录调控研究提供了基本材料。     

IL-37基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

[目的]克隆白介素-37(IL-37)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体,并分析活性。[方法]用PCR方法扩增IL-37基因5'端上游区3个不同长度的启动子片段,分别克隆入荧光素酶报告基因载体p GL3,构建IL-37基因启动子荧光素酶报告基因质粒。将所构建的质粒转染HEK-293细胞,通过双荧光素酶报告基因系统分析启动子的转录活性。[结果]754、1 017、2 043 bp等3个IL-37启动子片段正确亚克隆入荧光素酶报告基因载体,重组质粒转染HEK-293细胞后,双荧光素酶活性分析显示1 017 bp的启动子片段具有较强转录活性,约为对照组(空载体p GL3-basic)的10.9倍。[结论]成功克隆IL-37基因启动子,构建了大小为1 017 bp的IL-37基因启动子荧光素酶报告基因载体,为IL-37表达的调控机制的研究提供有效的工具。     

解偶联蛋白UCP1启动子荧光素酶报告基因载体的构建

目的:构建解偶联蛋白UCP1启动子荧光素酶报告基因载体,为寻找调控UCP1表达的小分子化合物提供有效工具。方法:从小鼠基因组DNA中PCR扩增小鼠UCP1启动子上游2000 bp序列,并将该序列连接到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,构建p GL3-UCP1启动子。测序正确后,提取质粒,然后将上述载体与p RL-TK载体共转染至HEK293细胞、小鼠白色脂肪前体细胞和小鼠棕色脂肪前体细胞,48 h后裂解细胞检测荧光素酶的活性。结果:通过PCR成功扩增获得了目的片段,并将其克隆至p GL3-basic中。与细胞内源UCP1表达水平相似,荧光素酶报告系统表明构建的p GL3-UCP1在棕色脂肪细胞中启动子活性最高,在白色脂肪细胞中活性较低,在HEK293细胞中基本没有活性。同时β3肾上腺素受体激动剂CL 316,243同样能够上调p GL3-UCP1的启动子活性。结论:成功构建了小鼠UCP1启动子荧光素酶报告基因载体,并证明在棕色脂肪细胞中,该启动子具有很强的启动子活性,而在白色脂肪和HEK293细胞中,启动子活性很低。该启动子报告系统有望为寻找激活UCP1的小分子化合物提供重要平台。     

人肝癌细胞LASP1 启动子的克隆及其核心调控区域的初步鉴定

目的:克隆人肝癌细胞的LASP1基因的启动子区域并找出该基因启动子的核心调控区域。方法:提取肝癌Hep G2细胞总DNA,PCR扩增不同长度的LASP1启动子片段,克隆至PGL3-Basic载体中构建重组表达载体PGL3-P1(2059 bp)、PGL3-P2(1123bp)、PGL3-P3(909 bp)、PGL3-P4(574 bp)和PGL3-P5(159 bp),转化入大肠埃希菌(E.coli)DH5α中,提取质粒经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆并测序。将构建的重组表达载体、PGL3-Basic载体分别与内参质粒PRL-Tk共转染Hep G2细胞,48 h后经双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测其活性。结果:PCR结果、双酶切结果以及DNA测序结果表明成功构建了LASP1启动子荧光素酶报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测结果显示,与PGL3-Basic组相比,重组载体PGL3-P1、PGL3-P2、PGL3-P3、PGL3-P4均具有较强的启动子活性(P0.01),其中,PGL3-P4的活性最强。结论:成功构建了人肝癌细胞不同截断长度的LASP1基因启动子荧光素酶报告基因载体,确定了LASP-1基因启动子的核心区域(-581 bp~-8 bp),为进一步研究LASP1基因在肝癌细胞中表达的关键调节因素及分子机制奠定了基础。     

小鼠组蛋白H3K4甲基化酶Smyd3启动子荧光素酶报告载体的构建与活性分析

为研究小鼠(Mus musculus)组蛋白H3 K4甲基化酶基因Smyd3转录调控的分子机制,本研究首先通过PCR的方法克隆了5条不同长度的Smyd3启动子5’端缺失片段,与pMD19-T载体连接后,双酶切克隆入pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,构建Smyd3启动子-pGL3-Basic报告基因重组质粒,瞬时转染HEK293细胞48 h后采用双报告基因检测试剂盒检测Smyd3启动子各缺失片段的相对荧光活性.结果表明,本研究成功构建Smyd3启动子5’端缺失片段-pGL3-Basic荧光报告基因重组质粒,所构建的启动子重组子转染组与阳性对照组相比表现出荧光活性,并且pGL3-Smyd3-4的荧光活性最强,是其他的2至4倍左右,pGL3-Smyd3-5的荧光活性最弱.本研究初步确定Smyd3基因的启动子核心区域可能位于-533～-42bp之间,在-2026～-533 bp之间可能存在启动子负调控序列.     

斑马鱼tnfb启动子的克隆和报告基因载体的活性分析

本研究通过采用生物信息学软件预测细胞因子tnfb基因5'上游2 000 bp左右的序列,并预测其相关的转录因子,克隆启动子,构建双荧光素酶报告基因表达载体,经双酶切和测序鉴定,最后通过双荧光素酶报告基因系统检测重组载体的活性。研究发现tnfb的转录因子结合位点为:Oct-1、TBP、GATA-1、RSRFC4、GLO、C/EBPα、NF-资B、ER、Pit-1a、Oct-2、Oct-2.1、RAP1。tnfb的启动子区没有发现Cp G岛,其5'侧翼序列含有与转录密切相关的TATA Box和CAAT Box转录元件。将tnfb的启动子片段插入p GL3-enhancer构建p GL3-tnfb-promoter-enhancer质粒后,质粒经酶切测序显示酶切片段大小一致,序列正确;转染了p GL3-tnfbpromoter的Raw264.7细胞的相对荧光素酶活性高于对照组细胞,双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的p GL3-tnfb-promoter-enhancer具有启动子活性。为研究tnfb参与的免疫相关的信号通路之间的调控提供了有力的研究工具。     

人apoA-Ⅰ基因启动子转录上调剂筛选系统的建立与应用

PCR扩增含有apoA-Ⅰ基因的转录调控序列的启动子片断（376 bp）,克隆入含有荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的pGL3B-neo载体中,构成受apoA-Ⅰ启动子调控的重组报告基因质粒pGL3B-neo：：apo,稳定转染人肝癌细胞株HepG2。通过细胞有限稀释法筛选稳定表达荧光素酶活性的细胞株SAPOA-Ⅰ。经apoA-Ⅰ转录调控因子PPARα激动剂的鉴定和细胞接种密度、溶剂使用浓度等条件的优化,成功建立了靶向apoA-Ⅰ基因启动子转录活性的报告基因筛选体系。应用该体系对400多种降脂中药提取物进行筛选,泽泻、罗布麻叶、山楂等提取物显示出较好的上调活性,与文献报道采用动物模型研究的结果一致。     

EphA3基因启动子区域定位表达及活性分析

目的构建含有不同长度EphA3基因启动子片段的报告基因载体,研究其在293T细胞和MEF细胞中的转录活性。方法以Balb／C小鼠基因组DNA为模板,扩增不同长度的EphA3基因启动子片段,并克隆进入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic真核表达载体内。酶切鉴定及基因测序无误后,将重组质粒和pRL—CMV内对照质粒共转染293T和MEF细胞,分析不同长度的OhA3基因启动子片段的转录活性。结果酶切和测序鉴定表明表达载体构建成功,EphA3基因的核心启动子区域位于-279bp～＋110bp之间,在293T细胞和MEF细胞中其转录活性相似。结论成功构建了荧光素报告基因重组质粒,并确定了BphA3基因的核心启动子区域。     

利用CpG DNA甲基化酶M.SssⅠ共表达载体制备限制性内切酶NotⅠ

限制性核酸内切酶是DNA重组的重要分子生物学工具。由于其本身对DNA有切割作用导致其重组表达在技术上十分困难,产率低、提纯程序复杂。而商业化生产所采用的利用专一型甲基化酶保护宿主DNA的限制酶表达技术流程繁琐、实用性有限。为表达NotⅠ限制酶,采用来源于Spiroplasma sp.MQ1的DNA甲基化酶M.SssⅠ特异性甲基化CpG序列,甲基化后的DNA会免受识别位点中包含CpG序列的限制酶NotⅠ的切割。将甲基化酶M.SssⅠ导入大肠杆菌表达宿主ER2566后,M.SssⅠ基因在宿主中持续表达并甲基化宿主DNA成CpG甲基化样式;利用此表达体系制备限制性内切酶NotⅠ获得成功。并借助引入纯化标签经过简便的Ni亲和层析和阴离子交换层析2步层析洗脱纯化,制备了高活力高纯度的重组限制酶NotⅠ。此表达体系可应用于一系列识别位点中包含CpG序列的限制酶的表达。     

含p27启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p27基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p27启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果显示扩增的p27启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p27报告基因的转录。结论:克隆了p27启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

Promoter analysis of the mouse Peg3 gene

Mouse Peg3 is a paternally expressed gene. Study of methylation of the Peg3 gene in P19 embryonal carcinoma cells suggested that monoallelic methylation of CpG dinucleotides is not only present in the promoter region, but also in the first exon and the first intron. Promoter activity analysis demonstrated that the minimal promoter of the Peg3 gene is located in the region between -827 and +712 and the critical region for promoter activity is between +423 and +712. We further identified the roles of the cis-elements, conserved sequence element (CSE) and YY1-binding sites, in the regulation of Peg3 expression and found that CSE is involved in the inhibition of Peg3 expression, while YY1-binding sites serve as activating cis-elements to antagonize CSE-mediated inhibition.     

拟南芥VHA-c3启动子的GUS基因融合表达

VHA-c3基因是拟南芥液泡H+-ATPase c亚基的5个同源基因之一,已有研究结果表明其与植物抗非生物胁迫有关。本论文在克隆不同长度VHA-c3基因上游调控序列的基础上,利用GUS报告基因,研究了VHA-c3基因的植物组织及器官定位。结果表明：VHA-c3起始密码子上游772bp的序列内存在着VHA-c3基因的基本启动子元件,可指导基因组成型表达在拟南芥的叶片、表皮毛、叶柄、根、雄蕊、柱头和萼片;在VHA-c3起始密码子ATG上游2812bp-2234bp片段和1496bp-772bp片段中各存在一个负调控元件,在2234bp-1496bp片段中存在一个正调控元件,它们的存在可控制基因在气孔中的表达。     

参与水稻光合作用的PsbR3基因启动子的功能分析

本实验旨在研究水稻光合作用蛋白中各基因的表达模式. 采用RT-PCR和定量real-time PCR数据分析水稻不同组织的mRNA表达水平.结果显示,PsaK和PsbR3基因仅在茎、叶等绿色组织表达,而胚、胚乳部分均不表达.通过其启动子克隆、植物表达载体构建,以及农杆菌介导转化后,GUS组织染化分析和GUS荧光定量分析表明,两启动子均为组织特异性优势表达,PsbR3启动报告酶GUS在叶片中的表达活性为Actin启动子的3.29倍,而PsaK启动报告酶GUS在叶片中的表达活性低于Actin启动子的.这些初步结果提示,PsbR3启动子决定水稻绿色组织茎叶的优势表达,PsbR3基因可能参与水稻光合作用.     

MET3 Promoter: A Tightly Regulated Promoter and Its Application in Construction of Conditional Lethal Strain

The β-galactosidase activity driven by MET3 promoter was assayed in the absence of methionine and in the presence of different concentration of methionine in medium. To compare its activity with GAL1 promoter and the data reported by Mumburg about MET25 promoter, the MET3 promoter was a weak but tightly controlled promoter. Its successful application in the construction of methionine-sensitive tri-mutant (cln1Δcln2Δpho85Δ) demonstrated that the MET3 promoter is a useful promoter in construction of conditional lethal strain and heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. Received: 20 September 2001 / Accepted: 22 October 2001     

人HAS3启动子的结构与功能初步分析

透明质酸合酶3（hyaluronan synthase 3,HAS3）,是一个参与透明质酸合成的酶分子,在上皮形成和肿瘤转移等过程中起重要作用.为了进一步研究HAS3基因的转录调控机制,本研究克隆鉴定了HAS3基因的启动子.首先应用5′RACE（rapid amplification of cDNA ends,cDNA末端快速扩增）技术鉴定了HAS3基因的转录起始位点,发现了丰度和转录起始位点不同的两种新的HAS3基因剪接变异体.通过PCR定向克隆策略,构建了覆盖HAS3基因5′端侧翼区起始密码子ATG上游约4.3 kb区域的一系列HAS3基因启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,HAS3基因启动子定位于转录起始位点附近约450 bp的区域内.转录因子结合位点分析表明,HAS3基因启动子缺乏典型的TATA盒,但含有典型的GC盒以及C/EBP等其它潜在的转录因子结合位点. 结果提示,Sp1和C/EBP等转录因子可能参与HAS3基因的转录调控.     

水稻重复序列RRD3在CHO和3T3细胞中的启动子活性

RRD3是通过变性 -复性动力学从水稻基因组中克隆到的一个中度重复序列 .将 RRD3作为启动子亚克隆到氯霉素乙酰基转移酶基因为报告基因的 p CAT载体上 ,转染 5种动物细胞 .结果表明在 CHO、3T3细胞中能够启动 CAT基因的表达 .利用核酸外切酶 和 PCR构建了 RRD3的系列缺失体 ,经转染后的 CAT活性分析表明 ,该序列中存在多个与哺乳动物细胞中启动基因表达有关的调控元件 .结合 RRD3在大肠杆菌和高等植物烟草中启动报告基因表达的活性 ,对重复序列与生物进化的关系进行了讨论 .     

Association Analysis of GABRB3 Promoter Variants with Heroin Dependence

GABRB3 encoding the β3 subunit of GABAA receptor has been implicated in multiple neuropsychiatric disorders, including substance abuse. Previous studies reported that SNPs at the 5′ regulatory region of GABRB3 could regulate GABRB3 gene expression and associated with childhood absence epilepsy (CAE). The study aimed to investigate whether SNPs at the 5′ regulatory region of GABRB3 were associated with heroin dependence in our population. We first re-sequenced 1.5 kb of the 5′regulatory region of GABRB3 gene to examine the SNP profile in the genomic DNA of 365 control subjects. Then, we conducted a case-control association analysis between 576 subjects with heroin dependence (549 males, 27 females) and 886 controls (472 males, 414 females) by genotyping the rs4906902 as a tag SNP. We also conducted a reporter gene assay to assess the promoter activity of two major haplotypes derived from SNPs at this region. We detected 3 common SNPs (rs4906902, rs8179184 and rs20317) at this region that had strong pair-wise linkage disequilibrium. The C allele of rs4906902 was found to be associated with increased risk of heroin dependence (odds ratio:1.27, p = 0.002). Two major haplotypes (C-A-G and T-G-C) derived from these 3 SNPs accounted for 99% of this sample, and reporter gene activity assay showed that haplotype C-A-G that contained the C allele of the tag SNP rs4906902 had higher activity than haplotype T-G-C. Our data suggest that GABRB3 might be associated with heroin dependence, and increased expression of GABRB3 might contribute to the pathogenesis of heroin dependence.     

大豆脂肪氧化酶-3基因(Lox3)启动子的克隆及其瞬时表达分析

利用PCR技术从大豆基因组DNA中分离脂肪氧化酶-3基因启动子片段Lox3p。PLACE在线启动子预测工具分析表明:序列中含有多种典型的种子及胚特异性表达元件。将克隆得到的Lox3p片段替换pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-Lox3p。通过农杆菌介导法在大豆种子中进行瞬时表达,GUS组织化学染色及荧光测定都显示出Lox3p驱动GUS基因表达的强度高于CaMV35S启动子。结果表明,该Lox3p启动子片段具备一定的胚特异表达特性,为探明大豆脂肪氧化酶-3基因启动子胚特异表达调控序列及其调控机制的研究奠定基础。