大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因的研究

目的 为了在大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因。方法 根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用的偏爱性,设计搭桥引物,并通过PCR扩增法合成了人β防御素的全基因序列,克隆进pGEX-4T-2中构建pGEX-4T-2-hBD-3融合表达载体。将表达载体转化E.coli宿主菌DH5α,进行IPTG诱导表达。将菌体反复冻溶使细胞膜穿孔,释放可溶性蛋白。融合蛋白GST-hBD-3经凝血酶切割。结果 研究得到了重组人防御素蛋白,琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明,重组人β防御素3对金黄色葡萄球菌有抗菌活性,抑菌效价为0.843 U。结论 人β防御素-3基因在大肠杆菌中得到了融合表达。     

人β防御素3在大肠杆菌中可溶性表达及其生物活性的鉴定

根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用的偏好,设计引物并通过酶促法合成了人β防御素3(hBD-3)全基因序列,克隆进pGEX-4T-2中构建pGEX-4T-2-hBD-3融合表达载体．将表达载体转化Ecoli宿主菌DH5α,进行IPTG诱导表达．控制诱导条件,提高可溶性蛋白的表达量．将菌体进行反复冻溶使细胞膜穿孔,释放可溶性蛋白．融合蛋白GST-hBD-3经凝血酶切割得到重组人防御素蛋白．用琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明,重组人β防御素3对金黄色葡萄球菌有抑菌活性．     

重组人β防御素-3抗菌活性及其影响因素研究

采用琼脂扩散法对重组人β防御素-3(rhβD-3)的抗菌谱、最小抑菌浓度及其抗菌活性影响因素进行研究。结果表明,rhβD-3对G~+、G~-及真菌均有抑制作用。rhβD-3对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为15μg/mL,对大肠杆菌的最小抑菌浓度为20μg/mL。对rhβD-3的抗菌活性影响因素进行测定,结果表明rhβD-3在pH6.0时抗菌活性最高;而且在-70℃~100℃条件下仍具有较高的抗菌活性;在高于100 mmol/L NaCl浓度下,抗菌活性随着NaCl浓度的升高而降低。     

融合抗菌肽基因在重组毕赤酵母的表达及体外活性研究

目的:在毕赤酵母SMD1168中表达融合抗菌肽,并检测其体外抑菌活性。方法:本实验从实验室先前构建的重组质粒pVAX1-RHKJT中克隆出已构建好的融合抗菌肽RHKJT基因片段,将RHKJT基因片段插入至pGAPZaA真核表达质粒中,通过PCR和测序验证,构建pGAPZα-RHKJT重组真核表达质粒,将线性化的pGAPZα-RHKJT电转化至毕赤酵母SMD1168中获得重组酵母SMDp G-RHKJT,并通过PCR和RT-PCR验证,对重组毕赤酵母SMDpG-RHKJT进行发酵,并收集发酵上清液进行体外生物活性测定。结果:成功获得重组酵母SMDpG-RHKJT菌株,重组酵母发酵上清液对大肠杆菌标准菌、大肠杆菌耐药菌、沙门氏菌标准菌、金黄色葡萄球菌标准菌、金黄色葡萄球菌耐药菌、肺炎链球菌标准菌均具有显著的抑菌活性。结论:重组酵母表达的融合抗菌肽具有较广的抗菌谱和较高的抑菌活性,具有良好的潜在应用前景。     

乳酸乳球菌表达重组牛乳铁蛋白肽的抑菌活性分析

牛乳铁蛋白肽是由牛乳铁蛋白经消化酶水解产生的一类具有广谱抑菌活性的短肽;乳酸乳球菌作为食品级微生物,既有天然的益生作用,又是理想的表达牛乳铁蛋白肽的载体。【目的】探究重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFcinBA/MG1363表达牛乳铁蛋白肽的抑菌活性。【方法】利用牛乳铁蛋白肽标准品绘制定量标准曲线来确定重组牛乳铁蛋白肽的含量,利用牛津杯法及微量肉汤稀释法测定重组牛乳铁蛋白肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等35株细菌的抑菌活性及最小抑菌浓度,利用扫描电镜、透射电镜、荧光显微镜、凝胶阻滞试验、黏附试验来探究重组牛乳铁蛋白肽对菌体结构、细菌DNA及黏附力的影响,利用CCK-8检测其对RAW 264.7细胞的毒性作用,并对小鼠红细胞溶血率进行测定。【结果】重组乳酸乳球菌上清中牛乳铁蛋白肽的浓度为24.39μg/mL,重组牛乳铁蛋白肽对测试的25株致病菌均有不同程度的抑制作用,抑菌浓度范围在16–128μg/mL,但对9株乳酸菌以及粪肠球菌没有明显的抑制作用,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、鸡白痢沙门菌的菌体完整性具有不同程度的破坏作用,其主要作用靶点为细菌的细胞膜,可以与细菌DNA结合...     

鸡β-防御素7在大肠杆菌中的表达及活性分析

【目的】根据鸡β-防御素7(Gal-7)的成熟肽基因序列合成基因,构建表达Gal-7的大肠杆菌工程菌,研究重组鸡防御素Gal-7成熟肽的体外生物活性。【方法】将合成的gal-7基因克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-6p-1中,得到重组质粒pGEX-6p-gal7,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达得到含GST标签的融合蛋白GST-Gal7;之后用Prescission蛋白酶将GST标签切除,并对成熟肽进行质谱分析;再利用琼脂打孔扩散法检测Gal-7成熟肽的体外抑菌活性,用2倍稀释法测定对指示菌的最低抑菌浓度。【结果】成功构建Gal-7大肠杆菌异源表达工程菌,表达纯化的重组Gal-7成熟肽质谱鉴定分子量为5 516 Da,其对黄色微球菌(NCIB 8166)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、粪肠球菌(ATCC 29212)、大肠杆菌(CMCC 44102)均有抑菌活性,最低抑菌浓度分别为16.875、67.5、67.5、135 mg/L。【结论】获得表达鸡Gal-7成熟肽的大肠杆菌工程菌,并且切除GST标签的Gal-7成熟肽具有生物活性。     

青天葵体外抑菌活性研究

目的:研究青天葵水提取液、醇提取液和水醇提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、伤寒沙门菌、绿脓杆菌、黑曲霉菌6种菌株的抑菌效果。方法:制备青天葵3种提取液,采用试管两倍稀释法测定3种提取液对金黄色葡萄球菌等6种菌株的最低抑菌浓度(MIC)。结果:青天葵水提取液对伤寒沙门菌的抑菌作用较强(MIC为12.5%),对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和黑曲霉菌的抑菌作用较弱(MIC为50%);醇提取液对伤寒沙门菌和绿脓杆菌都有很强的抑菌作用(MIC为6.25%),对金黄色葡萄球菌也有较强的抑菌活性(MIC为12.5%),对大肠杆菌的抑菌作用较弱(MIC为50%);水醇提取液的抑菌活性与醇提取液相当。结论:青天葵对金黄色葡萄球菌等6种菌株表现出不同程度的抑制活性。     

黄河三角洲土曲霉Aspergillus terreus OUCMDZ-1925中具抗菌活性的聚酮类天然产物

作者利用化学与生物活性相集成的筛选方法,从采自黄河三角洲地区——东营黄河口的梭鱼Chelon haematocheilus的内脏中分离鉴定了1株耐盐真菌土曲霉Aspergillus terreus OUCMDZ-1925,其发酵产物具有抗枯草芽孢杆菌活性。进一步采用色谱分离、波谱鉴定,从其固体发酵(大米培养基)中分离鉴定了5个化合物,即右旋丁内酯I(1)、丁内酯IV(2)、丁内酯II(3)、丁内酯III(4)和3,5,6-三甲基-2,4-二羟基苯甲酸甲酯(5)。并发现化合物1–3和5对金黄色葡萄球菌(ATCC51650)有强的抑菌活性(最小抑菌浓度均为0.31μg/mL,阳性对照环丙沙星的最小抑菌浓度为0.16μg/mL),化合物1和2对产气杆菌(ATCC13408)以及化合物1和3对枯草芽孢杆菌(ATCC93151)有中等的抑菌活性(最小抑菌浓度分别为6.25μg/mL和12.50μg/mL,阳性对照环丙沙星的最小抑菌浓度分别为1.25μg/mL和5.0μg/mL),化合物1–5对大肠杆菌(ATCC25922)以及化合物4对金黄色葡萄球菌(ATCC51650)有弱的抑制活性,且化合物1的产量高,达2.5g/kg,为其后续研究提供了新的药源。     

壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究

以乳化交联法制备的壳聚糖微米微球(CMs)为试验材料,研究其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌行为,并对其浓度因素、粒径因素和抑菌机理做了探讨。结果表明CMs的抑菌作用随其浓度的增加和粒径的减小而增强。在浓度<0.7 mg/mL时,CMs对细菌的生长具有先抑制后促进的作用;当浓度≥0.7 mg/mL时对细菌有杀灭作用。CMs对两种细菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为0.8、1.4 mg/mL和1.0、1.8 mg/mL,表明壳聚糖微球对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有明显的抑制作用,且金黄色葡萄球菌对微球抑制作用的反应比大肠杆菌更敏感。扫描电子显微镜观察发现,细菌能迅速贴附在CMs表面,并且贴壁后的细菌发生了明显的形态变化,有的甚至完全被破坏。     

人α防御素5在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化研究

采用PCR扩增大肠杆菌偏好的人α防御素5成熟肽(mHD-5)密码子序列, 并将其克隆至pMAL-p2x质粒, 构建pMAL-p2x-mHD-5表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 诱导表达, SDS-PAGE分析目的蛋白表达量并优化表达条件。经亲和层析、酶切和离子交换层析等方法分离、纯化重组mHD-5(rmHD-5)多肽。采用浊度法测定rmHD-5对细菌的抑制活性。通过优化表达条件, 获得约30%的可溶性目的蛋白表达量, 并成功纯化rmHD-5。rmHD-5对大肠杆菌标准菌株(ATCC25922)具有较强的抑制活性, 在终浓度为62.5mg/mL时, 90%以上的细胞被抑制。结果表明采用可溶性融合表达策略, 在原核表达系统中诱导表达并纯化具有生物活性的防御素是可行的途径之一。