骨骼肌中肌浆网/内质网钙ATP酶的功能及其作用机制

骨骼肌是机体生命活动和能量代谢的重要场所,其代谢紊乱会诱发一系列肌肉疾病。Ca²⁺作为肌肉收缩过程的重要调节器,在骨骼肌的功能行使中发挥重要作用。骨骼肌细胞中Ca²⁺浓度主要受肌浆网/内质网钙ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca²⁺ATPase, SERCA)的调节。SERCA利用ATP水解产生的能量介导胞质Ca²⁺进入肌浆网内腔,维持胞质Ca²⁺平衡。SERCA功能的失调会引发一系列骨骼肌疾病,而SERCA活性受部分肌浆网蛋白质的调控,跨膜蛋白质PLN、SLN、MRLN、DWORF和sAnk1以及胞质蛋白质THADA和SAR,其通过磷酸化,进而调控SERCA的功能。本文对骨骼肌中SERCA的功能、调控SERCA的相关功能蛋白质的结构及其作用机制进行了总结,以期为骨骼肌相关疾病的治疗提供最新的思路和方法。     

心力衰竭家兔心肌肌浆网钙回摄功能的异常及其影响因素

本文旨在探讨心力衰竭家兔心肌肌浆网钙回摄功能的异常及其影响因素和可能的机制。用主动脉破瓣术加腹主动脉缩窄术造心衰模型,用钙离子荧光成像仪检测心肌肌浆网钙回摄功能,用无机磷酸根法测定心肌肌浆网钙泵的活性,用Western blot检测各组心肌组织中肌浆网钙泵(SERCA2a)、受磷蛋白(PLB)、16位丝氨酸磷酸化-受磷蛋白(PLB-Ser16)、17位苏氨酸磷酸化-受磷蛋白(PLB-Thr17)、Ca2+∕钙调素依赖的蛋白激酶II(CaMKII)、蛋白激酶A(PKA)和蛋白磷脂酶(PP1α)的蛋白表达,用γ-32P底物掺入法测定CaMKII、PKA的活性。结果显示,与假手术组相比,心衰组钙回摄量显著下降(P0.01),SERCA2a在心肌中的表达量和活性均显著下降(P0.05),PLB的表达水平及其磷酸化位点(Ser16、Thr17)的磷酸化状态明显降低(P0.05),且PKA和CaMKII的表达及活性均明显升高(P0.05或P0.01),PP1α的表达量显著升高(P0.05)。以上结果证实心衰家兔模型心肌肌浆网钙回摄功能的异常与SERCA2a的表达活性、PLB及其磷酸化水平均显著下降有关,提示PLB的两个磷酸化位点(Ser16、Thr17)可能共同参与心衰家兔心肌肌浆网钙泵活性的调节。     

钙离子ATP酶SERCA1a的结构与功能研究进展

兔成年骨骼肌型肌浆网-内质网钙离子转运ATP酶(adult skeletal sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-transporting ATPase,SERCA1a)是结构与功能研究得最好的膜蛋白之一,可利用ATP水解释放的能量,逆浓度梯度将胞浆内钙离子转运入内质网钙库,保证骨骼肌收缩舒张的正常进行。近年来,X-射线晶体衍射分析获得的数十个高分辨率晶体结构提供的结构信息,结合生化检测获得的重要氨基酸残基突变对SERCA1a反应循环动力学的影响,使对SERCA1a分子构象的周期性变化以及SERCA1a如何转运钙离子、自身磷酸化与去磷酸化等重要过程的理解更加清晰且深入。SERCA1a结构与功能的研究进展对P型离子转运ATP酶的基础与应用研究具有指导意义与促进作用。     

L78部分氨基酸残基对SERCA1a钙转运功能的影响

跨肌浆网膜的钙离子ATP酶SERCA1a可在水解ATP的同时逆浓度梯度从胞浆转运钙离子入肌浆网,引发收缩的骨骼肌细胞舒张.目前对SERCA1a结构与功能的研究,要领先于对其他P型离子转运ATP酶的研究.为了解SERCA1a跨膜螺旋M7与M8膜内侧连接部Linker78(L78)的功能,我们评估了L78部分氨基酸残基突变对SERCA1a反应循环的影响,发现:除G864A之外的所有突变体均可不同程度地降低钙离子转运速率;G862或P863氨基酸残基的突变导致SERCA1a的ATP酶活性显著降低或丧失,并引起由ATP或无机磷酸Pi生成的磷酸化酶中间体EP量显著减少;A893被P取代对SERCA1a的影响与G862、P863突变相似;与野生型SERCA1a相比,G864A与FMQ873-875单突变体ATP酶活性及EP生成量无明显差别.上述结果表明,M7、M8膜内侧连接部L78不仅与跨膜区钙离子转运过程密切相关,而且L78在GPG862-864处及A893附近的正确转折对胞浆结构域P的磷酸化也具有关键的远距离调控作用,提示L78的结构及柔度对SERCA1a构象正常的周期性变化至关重要.     

长时间电刺激引起肌肉结构损伤过程中细胞内各种元素的分布

利用快速冷冻固定和电子微探针技术,对电刺激诱发爪蟾延迟性肌肉损伤过程中肌浆网与胞浆钙、镁、钠、钾进行定量分析。电刺激后３ｈ,胞浆钙增加３．０ｍｍｏｌ／ｋｇｄｗ,肌浆网钙下降７．５３ｍｍｏｌ／ｋｇｄｗ。至刺激后６ｈ,胞浆钙增加达５．３３ｍｍｏｌ／ｋｇｄｗ,肌浆网摄取钙加强。在延迟性结构变化发展中,细胞内钠、钾也持续上升,而镁则逐渐下降。结果表明,延迟性肌肉结构异常与胞浆钙增高具有一致性。胞浆钙上升可能由于细胞内钠增加,钠－钙交换受抑及肌膜受损,外钙内流增加。肌浆网钙摄取下降则是运动后初期胞浆钙增高的另一途径。损伤肌中胞浆钾浓度有增高和下降两种变化,其意义与机制有待进一步探讨。     

中国人扩张型心肌病与受磷蛋白基因关系的研究

受磷蛋白（phospholamban）是心肌收缩的一个重要调节因子,可抑制心肌肌浆网钙ATPase的活性、降低其对钙的亲和力。正常情况下,受磷蛋白可被不同的蛋白激酶磷酸化从而解除其肌浆网钙ATPase的抑制作用。国外两个DCM家系研究发现受磷蛋白基因突变与DCM的发生有关,研究目的旨在探讨中国人群心肌特异性受磷蛋白基因突变与特发性扩张型心肌病发病的关系。收集60例确诊的特发性扩张型心肌病患者临床资料,采集血样本并分离白细胞和提取基因组DNA。应用PCR扩增肌特异性受磷蛋白基因片段,经测序检测基因突变的存在。结果显示60例扩张型心肌病人受磷蛋白基因开放阅读框未发现突变,仅有两例患者出现阅读框3′部分非翻译区分别离终止密码153和173位单个碱基T的缺失。两例患者终止密码后非翻译区单个碱基T的缺失据分析并无实际意义。因此我们认为绝大部分中国人扩张型心肌病的发病可能与受磷蛋白基因突变无关。Abstract: Phospholamban (PLB) is a prominent regulator of myocardial contractility and a reversible inhibitor of the cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase activity. In normal cardiac muscles, phospholamban can be phosphorylated at distinct sites by various protein kinases and release its inhibition to sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase. The studies of pedigrees have shown dilated cardiomyopathy (DCM) is related with mutation of PLB. The aim of present study is to investigate the relationship between mutation of PLB gene and DCM. Sixty patients with idiotic DCM were enrolled in present study. The clinical data were collected, including clinical symptoms, ECG and echocardiography. Peripheral blood samples of all these subjects were collected to extract genome DNA. The fragments of PLB gene were amplified by PCR and PCR fragment sequencing was performed to study weather mutation of phospholamban gene exists. phospholamban gene did not show any mutation in these patients. Most Chinese DCM patients may not be related with mutation of PLB gene.     

钙敏感受体对大鼠糖尿病性心肌病的影响

目的:观察钙敏感受体(Ca SR)在大鼠糖尿病性心肌病中的作用。方法:30只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、糖尿病4周组和糖尿病8周组(n=10)。高糖高脂饮食4周后腹腔注射STZ(30 mg/kg)建立糖尿病模型。通过透射电镜观察心肌超微结构的变化,通过Western blot检测心肌组织Ca SR、肌浆网Ca2+-ATPase(SERCA)和受磷蛋白(PLN)的蛋白表达。结果:与对照组相比,随着病程的延长糖尿病组大鼠心肌Ca SR、SERCA蛋白表达降低,PLN表达增加,心肌结构损伤逐渐加重。结论:在大鼠糖尿病性心肌病进展过程中Ca SR的表达逐渐降低,并可能导致钙稳态紊乱参与糖尿病心肌病的发生。     

肌浆网钙ATP酶过表达对心房颤动兔心房及L型钙通道a1c蛋白表达的影响

目的探讨心肌肌浆网钙ATP酶2a(SERCA2a)基因过表达,对兔急性心房颤动(AF)的心房肌L型电压依赖钙通道蛋白alc亚单位(LVDCCalc)表达的影响。方法 48只成年新西兰兔,随机分成为房颤组(AF组,n=12)、9-型腺相关病毒+增强型绿色荧光蛋白组+房颤组(rAAV9+EGFP+AF组,n=12)、9-型腺相关病毒+肌浆网钙ATP酶2a+增强型绿色荧光蛋白组+房颤组(rAAV9+SERCA2a+EGFP+AF组,n=12),并设假手术组作为对照(Control组,n=12)。rAAV9+EGFP+AF组和rAAV9+SERCA2a+EGFP+AF组起搏前30 d开胸心包腔内注射包含报告基因的rAAV9-EGFP和包含靶基因的rAAV9-SERCA2a-EGFP各500μL(1×1012v.g/μL)。转染30 d后,AF组、rAAV9+EGFP+AF组和rAAV9+SERCA2a+EGFP+AF组,以600 BPM刺激频率,持续起搏兔右心房24h制作AF模型。处死各组动物,倒置荧光显微镜下观察右心房肌组织EGFP表达情况,行HE染色对右心房组织形态检查,应用免疫组化技述检测SERCA2a蛋白及LVDCCalc蛋白在心房肌中的表达情况。结果 rAAV9+EGFP+SERCA2a+AF组SERCA2a蛋白及LVDCCalc蛋白表达量显著高于AF组和rAAV9+EGFP+AF组(P<0.05),但与对照组比较差异无显著性。结论心房肌转SERCA2a基因,显著减少了急性房颤心房肌的LVDCCa1c蛋白表达的降低,有逆转急性AF电重构的作用。     

应用Ad Easy腺病毒载体系统构建人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)

目的:利用Ad easy腺病毒表达系统构建含人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒.方法:将人SERCA2a基因全长c DNA(3700bp)插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,成功构建pAd-TrackCMV SERCA2a重组质粒,经Pme I酶切线性化,采用电击法转入到已含Ad easy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组.挑选同源重组质粒,Pac I酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒,荧光检测有绿色荧光蛋白表达.将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测SERCA2a可以在大鼠心肌细胞过表达且影响了胞内SERCA2a的活性.结果:成功包装含人SERCA2a基因的重组腺病毒,并可以有效感染SD大鼠心肌细胞.结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人SERCA2a基因的腺病毒,为以后进一步研究人SERCA2a基因治疗提供了新途径.     

肌浆网钙泵蛋白的结构和功能及其蛋白单体的特性

肌浆网是细胞钙平衡的主要调节单位之一,是胞浆钙离子浓度异常的重要研究对象。肌浆网结构组成简单,便于分离纯化,是理想的生物膜研究模型。本文介绍了肌浆网钙泵蛋白的分子结构、钙转运分子机制和钙泵蛋白的聚集状态及磷脂结构与钙转运的关系。     

可溶性耐药相关钙结合蛋白

可溶性耐药相关钙结合蛋白(sorcin)是一个21.6 kD的胞浆蛋白,具有典型的EF手臂(EF-hand)钙结合位点, 广泛存在于多种组织中,在心肌细胞中含量最丰富.Sorcin可与肌浆网钙离子通道RyR相互作用影响心肌细胞兴奋——收缩偶联.另一方面,sorcin在肿瘤耐药细胞中大量表达,它可以与细胞中钙离子结合,引起细胞内游离钙离子浓度下降,然后导致钙离子所介导的磷酸酶活性降低,使得具有排药功能的P-gp糖蛋白磷酸化水平下降,最终导致耐药.一旦明确引发和维持细胞耐药的作用机制,就可为克服肿瘤耐药提供新的靶点.同时随着RyR活性抑制作用研究的深入,有望通过sorcin转基因技术治疗心力衰竭.本文主要对sorcin的结构特点和生物学特性进行综述,并初步分析其耐药机制.     

青蛙心肌细胞膜在调节肌浆钙离子浓度中所起作用的定量考虑

在骨胳肌兴奋-收缩耦联过程中,肌浆钙离子浓度主要由肌浆网系调节。青蛙心肌细胞的肌浆网系不发达,没有横管,且细胞直径很小,因此肌浆钙离子浓度很可能由发生在肌膜上的过程调节。本文从定量角度验证这一设想的可能性。假定青蛙心肌细胞兴奋时钙离子顺浓度差从细胞外跨膜扩散入细胞使肌浆钙浓度升高,又经肌膜上类似载体作用的主动过程将钙离子排出细胞,由此计算静息蛙心肌在某一频率的重复刺激下肌浆钙离子浓度随刺激次数的变化以及对不同刺激频率当收缩张力达稳态时肌浆内钙浓度值。利用肌肉稳态收缩张力和细胞内钙离子浓度之间已知的单值关系可以看到,计算结果同实验记录的蛙心肌稳态张力与刺激频率间的“阶梯”关系符合得很好,说明青蛙心肌细胞膜在调节肌浆钙离子浓度中起决定作用这一想法从定量角度考虑也完全是可能的.     

6周有氧运动对高脂膳食的ApoE敲除小鼠骨骼肌钙调控的影响*

目的: 探讨6周有氧运动对高脂膳食的载脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠骨骼肌肌浆网钙调控蛋白的影响。方法: 25只9周龄ApoE敲除小鼠(ApoE KO)随机选取5只ApoE KO小鼠进行最大跑速测试(以初始速度为4.8 m/min,坡度为0°,持续5 min后,每3 min速度增加1.2 m/min,直至力竭,最后速度为最大跑速,最大跑速的测试结果为(27.0±2.4)m/min,剩余20只ApoE KO小鼠随机分为ApoE KO小鼠高脂膳食组(KO)和ApoE KO小鼠高脂膳食+有氧运动组(KE),每组10只,同时以10只9周龄野生型C57BL/6J小鼠作为空白对照组(WT)。高脂饲料成分:脂肪含量为21%(w/w),胆固醇含量为1.5%(w/w)。KE组适应性训练1周后开始运动干预,运动方案为:40%最大跑速(10.8 m/min),运动时间40 min/d,频率每周3 d,共计6周。待末次运动后48 h,所有小鼠麻醉后经心脏穿刺处死后迅速分离双侧腓肠肌;可见光比色法检测骨骼肌Ca²⁺浓度;Western blot法检测小鼠骨骼肌肌浆网钙调控蛋白RyR、CaM、CaMKⅡ、SERCA1、SERCA2蛋白表达。结果: 与WT组相比,KO组小鼠骨骼肌Ca²⁺浓度显著降低(P＜0.01),骨骼肌肌浆网钙释放蛋白RyR、CaMKⅡ和钙回收蛋白SERCA1、SERCA2均显著降低(P＜ 0.05),但CaM蛋白无显著变化;与KO组相比,KE组小鼠骨骼肌Ca²⁺浓度和骨骼肌肌浆网钙回收蛋白SERCA1、SERCA2均显著升高(P＜0.05),但骨骼肌肌浆网钙释放蛋白RyR、CaM、CaMKⅡ蛋白表达均无显著性差异。结论: 高脂膳食可使ApoE敲除小鼠骨骼肌Ca²⁺浓度降低、肌浆网钙释放作用和钙回收作用减弱,6周有氧运动训练能够显著提高其Ca²⁺浓度、促进肌浆网钙回收作用。     

植物机械响应中的钙通信北大核心CSCD

以胞质钙离子浓度变化(钙信号)为核心的钙通信系统在植物机械响应中发挥着不可替代的作用。本文综述了机械刺激诱导的植物细胞钙信号及其生理作用、植物机械敏感钙通道,以及TCH基因编码的钙调蛋白和钙调蛋白类似蛋白等的研究进展,总结了该领域尚待解决的问题,并对未来的研究方向进行了展望。     

磷酸二酯酶9型抑制剂PF-04449613对大鼠心脏正性肌力作用及其机理

本文旨在研究磷酸二酯酶9型抑制剂PF-04449613对大鼠心脏正性肌力作用及其机理。采用在体双压力-容积环及离体心脏收缩力技术分析其对成年健康大鼠心脏正性肌力的作用特点;运用大鼠心肌细胞钙释放技术分析其作用机理。双压力-容积环实验表明:PF-04449613 (5.5 mg/kg)显著增加大鼠搏出功、心输出量、每博输出量、收缩末期压力及射血分数(P 0.05),降低收缩末期容积、舒张末期容积及舒张末期压力(P 0.05)。PF-04449613对外周动脉血压的作用表现为增加收缩压、降低舒张压及血管阻力(P 0.05)。大鼠离体心脏灌流实验表明,PF-04449613浓度依赖性地增加离体大鼠左心室发展压(P 0.05)。以Fluo-4 AM为钙离子荧光指示剂的钙释放结果表明,PF-04449613 (5μmol/L)显著增强肌浆网钙泵(sarcoplasmic reticulum Ca~(2+)-ATPase-2a,SERCA2a)介导的钙释放下降相的快成分,显著增加大鼠心肌细胞钙释放幅值(P0.05)。PF-04449613 (5μmol/L)降低肌浆网钙泄漏率(P 0.05)。以上结果提示,PF-04449613通过增加SERCA2a活性发挥其对大鼠心脏正性肌力作用。     

小鼠腹水型肝癌H22a细胞浆内一种特异性酸性磷酸酶的研究

<正> 许多实验室都报道从一些组织中纯化出的能使蛋白质的酪氨酸残基脱磷酸化的磷蛋白磷酸酶也具有使PNPP(对硝基酚磷酸钠)脱磷酸基团的活力。我们曾对小鼠腹水型H22a肝癌细胞胞浆中的磷蛋白磷酸酶进行了纯化和性质研究,在粗酶液经DEAE-Sephadex A50柱层析时,发现磷蛋白磷酸酶和对PNPP具酶活力的蛋白成分是可以分开的,本文对具PNPP酶活     

心肌肌浆网膜钙泵调节蛋白——受磷蛋白的结构与功能

受磷蛋白(phospholamban,PHL)是心肌肌浆网膜钙泵的调节蛋白。它是由五个相同亚基组成的分子量为25000Da的寡聚体膜蛋白。它对心肌钙泵的调节是通过磷酸化和脱磷酸化作用来实现的。磷酸化作用使它在SDS-PAGE上表观分子量的变化显示出其亚分子结构的复杂性。本文着重介绍了在心肌兴奋-收缩偶联过程中,受磷蛋白的调节作用以及它的结构特征。     

肌浆网钙ATP酶过表达对心房颤动兔心房及L型钙通道alc蛋白表达的影响

目的探讨心肌肌浆网钙ATP酶2a（SERCA2a）基因过表达,对兔急性心房颤动（AF）的心房肌L型电压依赖钙通道蛋白alc亚单位（LVDCCalc）表达的影响。方法48只成年新西兰兔,随机分成为房颤组（AF组,n=12）、9一型腺相关病毒＋增强型绿色荧光蛋白组＋房颤组（rAAV9＋EGFP＋AF组,n=12）、9一型腺相关病毒＋肌浆网钙ATP酶2a＋增强型绿色荧光蛋白组＋房颤组（rAAV9＋SERCA2a＋EGFP＋AF组,n=12）,并设假手术组作为对照（Control组,,l=12）。rAAV9＋EGFP＋AF组和rAAV9＋SERCA2a4-EGFP4-AF组起搏前30d开胸心包腔内注射包含报告基因的rAAV9一EGFP和包含靶基因的rAAV9-SERCA2a—EGFP各500肛L（1×10”v．g／ptL）。转染30d后,AF组、rAAV9＋EGFP＋AF组和rAAV9＋SERCA2a＋EGFP＋AF组,以600BPM刺激频率,持续起搏兔右心房24h制作AF模型。处死各组动物,倒置荧光显微镜下观察右心房肌组织EGFP表达情况,行HE染色对右心房组织形态检查,应用免疫组化技述检测SERCA2a蛋白及LVDCCalc蛋白在心房肌中的表达情况。结果rAAV9＋EGFP＋SERCA2a4-AF组SERCA2a蛋白及LVDCCalc蛋白表达量显著高于AF组和rAAV9＋EGFP＋AF组（P〈0．05）,但与对照组比较差异无显著性。结论心房肌转SERCA2a基因,显著减少了急性房颤心房肌的LVDCCalc蛋白表达的降低,有逆转急性AF电重构的作用。     

钙调磷酸酶信号调控真菌生长代谢、毒力及抗逆性能

钙调磷酸酶是一种丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白磷酸酶,在真菌中普遍保守,上游信号途径由Ca2+通道(Cch1)、转运蛋白(Mid1)、钙离子感应蛋白(CaM)、钙调蛋白依赖性磷酸酶等组成。钙调磷酸酶受钙离子和钙调蛋白调节,在调控真菌Ca2+稳态的钙信号级联途径中发挥着中心作用,通过钙信号级联途径参与生物学过程,调控真菌生长、发育和毒力形成来响应外界环境因素的变化,使真菌能够适应不同环境,维持正常的生命活动。本文综述了真菌钙调磷酸酶信号的组成和上下游信号转导途径、调控细胞生长代谢、毒力形成以及抗逆性能调控的研究进展;结合对真菌代谢产物合成的调控作用,对钙调磷酸酶信号作为重要合成生物学元件及调控开关进行了展望。     

选择标记法对钙调神经磷酸酶和钙调素结合位点的研究

钙调素是一种多功能的钙调节蛋白。在细胞调节中,它往往需要与细胞里一些活性物质。蛋白质、酶等相结合而进行作用。钙调神经磷酸酶(Calcineurin)是新近发现的一种活性直接受Ca~(2 )、钙调素调节的磷蛋白磷酸酶。因此,钙调素如何和钙调神经磷酸酶结合,它们的结合位点等问题就成为这两个领域的研究者共同关心且迫切需要解决的课题。最近,我们用