日本七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺表达序列标签(EST)分析

以日本七鳃鳗口腔腺为材料,构建库容量为2.1×106pfu/mL的cDNA文库。通过对文库中克隆子的序列测定和生物信息学初步分析,得到1323条有效EST序列。经BlastX及BlastN软件进行同源对比分析,653条(49.36%)EST可在蛋白质或核苷酸水平上找到同源序列,其中328条与七鳃鳗科物种同源。同源序列功能分类大致分为11类,与蛋白质合成有关的蛋白所占比例最大。1323条EST进行片段重叠群分析(contig analysis)获得包括547条序列在内的162组片段重叠群并确定了8条全长cDNA。日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库以及EST文库的成功构建,为研究日本七鳃鳗口腔腺的功能基因和蛋白质组学奠定了基础。     

日本七鳃鳗富含半胱氨酸RGD蛋白Lj-RGD1抑制血小板聚集及抗血管新生功能

Lj-RGD1来源于日本七鳃鳗口腔腺,富含半胱氨酸并具有RGD(Arg-Gly-Asp)模体.为了验证Lj-RGD1是否具有抑制血小板聚集、抗血管新生等去整合素样典型功能,本文对七鳃鳗Lj-RGD1进行了克隆表达及活性测定.提取七鳃鳗口腔腺中总RNA进行RT-PCR扩增,获得Lj-RGD1的420 bp cDNA.对其进行克隆、表达及组氨酸亲和层析纯化后,获得分子量为169 kD的可溶性蛋白rLj-RGD1.活性测定结果显示,rLj-RGD1呈剂量依赖方式抑制ADP诱导的兔血小板聚集,IC50为123 μmol/L;血管新生抑制实验结果表明,rLj-RGD1能够诱导ECV304细胞凋亡,抑制ECV304细胞增殖和管状物形成,并呈剂量依赖性方式抑制鸡胚胎绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane,CAM）血管新生.由此可见,Lj-RGD1具有去整合素样生物活性,在血栓或血管异常新生类疾病治疗中具有应用前景.     

东北七鳃鳗肠道应答气单胞菌免疫刺激相关蛋白的鉴定北大核心CSCD

动物肠道中寄生的微生物与宿主的营养、免疫及防御功能密切相关。本研究在东北七鳃鳗肠道中分离获得一株优势细菌,并鉴定为气单胞菌属(Aeromonads sp.)。建立了荧光定量PCR快速检测气单胞菌拷贝数的方法,经poly(I∶C)刺激后,气单胞菌数量下降1.15倍。因此,该肠道气单胞菌被认为是七鳃鳗肠道适应性免疫系统进化的关键菌群之一。为了进一步分析气单胞菌对东北七鳃鳗肠道适应性免疫影响的分子机制,将分离菌株腹腔注射七鳃鳗,利用双向电泳技术鉴定了七鳃鳗肠道应答气单胞菌免疫刺激的相关蛋白。共鉴定19个差异表达蛋白质,其中12个蛋白质表达上调,5个蛋白质表达下调,1个蛋白质刺激后消失,1个新增蛋白质,并对蛋白质功能进行分类。七鳃鳗肠道应答气单胞菌免疫刺激的差异表达蛋白分别参与了七鳃鳗适应性免疫调控、信号转导及能量代谢等。该研究可拓宽对七鳃鳗免疫研究的途径,为深入探讨适应性免疫系统发育提供理论基础和新的研究思路。     

东北七鳃鳗肠道应答气单胞菌免疫刺激相关蛋白的鉴定

动物肠道中寄生的微生物与宿主的营养、免疫及防御功能密切相关。本研究在东北七鳃鳗肠道中分离获得一株优势细菌,并鉴定为气单胞菌属（Aeromonads sp.）。建立了荧光定量PCR快速检测气单胞菌拷贝数的方法,经poly(I∶C)刺激后,气单胞菌数量下降115倍。因此,该肠道气单胞菌被认为是七鳃鳗肠道适应性免疫系统进化的关键菌群之一。为了进一步分析气单胞菌对东北七鳃鳗肠道适应性免疫影响的分子机制,将分离菌株腹腔注射七鳃鳗,利用双向电泳技术鉴定了七鳃鳗肠道应答气单胞菌免疫刺激的相关蛋白。共鉴定19个差异表达蛋白质,其中12个蛋白质表达上调,5个蛋白质表达下调,1个蛋白质刺激后消失,1个新增蛋白质,并对蛋白质功能进行分类。七鳃鳗肠道应答气单胞菌免疫刺激的差异表达蛋白分别参与了七鳃鳗适应性免疫调控、信号转导及能量代谢等。该研究可拓宽对七鳃鳗免疫研究的途径,为深入探讨适应性免疫系统发育提供理论基础和新的研究思路。     

七鳃鳗g型溶菌酶的分子特征和抗菌活性

溶菌酶是先天免疫系统中对抗细菌病原体感染的一种关键蛋白．本研究从七鳃鳗中克隆g型溶菌酶基因. 其酶基因cDNA为701 bp（GenBank 序列号KP204854）,开放阅读框为555 bp,编码由184个氨基酸组成的多肽,理论分子质量为20.24 kD,等电点为5.48,含有1个半胱氨酸残基,无信号肽．实时荧光定量PCR分析表明,七鳃鳗g型溶菌酶基因在各组织中广泛表达,其中在肠中表达量最高．脂多糖（LPS）体内刺激七鳃鳗后发现,溶菌酶在口腔腺和头肾表达量显著升高．以溶壁微球菌和哈维弧菌为底物检测重组g型溶菌酶的活性时,均表现出抗菌活性,最适pH为7.5,最适温度为35℃．扫描电镜分析表明,重组酶能够使溶壁微球菌破裂．以上结果均表明,g型溶菌酶在七鳃鳗的先天免疫系统防御病菌感染中起到重要作用．     

日本七鳃鳗消化系统显微与超微结构

采用光镜和电镜技术研究日本七鳃鳗(Lampetra japonica)消化系统的组织结构。结果显示,日本七鳃鳗食道褶皱处黏膜上皮为复层立方上皮,褶皱基部为变移上皮。由于生活方式的特化,其胃退化。前肠、中肠和后肠黏膜上皮均为单层柱状上皮,其中并未发现杯状细胞,有肠腺,肠上皮有密集的纤毛,上皮细胞内各种细胞器均较丰富,肌纤维斜行。肝小叶界限不清,肝内无胆管。内分泌性胰由若干个大小不等和形状不定的细胞团组成。口腔腺上皮细胞高柱状,游离端充满酶原颗粒和微管泡系,细胞间有分泌小管。日本七鳃鳗消化器官的组织结构特点与其特殊的取食方式和进化地位密切相关。     

日本七鳃鳗RGD毒素肽Lj-RGD2的克隆、表达及其抗血管新生活性

日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白Lj-RGD2毒素肽分子质量为8 kD,是含有2个RGD（Arg-Gly-Asp）模体序列的多肽.为了探讨其是否具有RGD毒素蛋白的功能,对其基因进行了克隆和表达,并对其重组蛋白进行了抗血管新生活性研究.从日本七鳃鳗口腔腺中提取mRNA,以自行设计的引物进行RT-PCR扩增,以获得Lj-RGD2基因;将获取的目的基因与pET23b载体连接,经转化、克隆、阳性转化子的筛选鉴定;将含组氨酸标签的pET23b-Lj-RGD2转化BL21菌中诱导表达;经亲和层析纯化,获得可溶性重组rLj-RGD2蛋白,并对重组rLj-RGD2蛋白的抗血管新生功能进行了研究.结果显示,rLj-RGD2蛋白的IC50为1.77μmol/L,并以剂量依赖方式抑制人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖;rLj-RGD2蛋白还能抑制ECV304细胞对人工基质膜Matrigel的黏附、以BFGF（basic fibroblast growth factor）为趋化剂的迁移及侵袭.鸡胚绒毛尿囊膜CAM（chick chorioallantoic membrane）血管新生实验结果表明,rLj-RGD2蛋白能以剂量依赖方式抑制BFGF诱导的CAM血管新生.由此可见,rLj RGD2蛋白具有RGD毒素肽的活性特征,其有望成为一种抗血管新生基因工程新药. 关键词日本七鳃鳗; RGD毒素蛋白; 细胞黏附; 迁移及侵袭; 血管新生     

日本七鳃鳗(Lampetra japonica)Lyb基因的克隆与分析

摘要: 采用RT-PCR和RACE技术, 从日本七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺、肝脏中分离获得了3条Y-box基因序列, 分别命名为Lyb1、Lyb2和Lyb3, 生物信息学分析其编码的蛋白质序列长度分别为331、181和171个氨基酸残基。采用DNAMAN软件, 将七鳃鳗的3个Y-box蛋白氨基酸序列与海鞘、斑马鱼、清鳉、河豚鱼和小鼠Y-box蛋白进行同源性分析, 结果显示他们共有一个保守的冷休克结构域, 其中包含两个RNA结合基序RNP-1和RNP-2, 表明获得的Lyb基因属于Y-box 基因家族成员。此外, 从Swiss-Prot下载了经实验验证过的Y-box蛋白序列数据, 结合实验克隆得到的Lyb基因所编码的氨基酸序列构建系统发育树, 发现Y-box基因在有颌类出现以前只有一种类型, 有颌类出现以后, Y-box基因分化成YB1、YB2和CSDA三种类型。     

七鳃鳗——铁代谢研究的极佳模型

七鳃鳗历经5亿年的进化历程,所处的自然环境具有低温及铁含量较高等特点,且在变态发育过程中组织结构和生命机制已经发展出其独特的适应性的进化方式,这为人们进一步研究生命起源和进化提供了新的方向。铁是人体必需的营养素之一,在代谢过程中发挥重要的作用,但当过量时可能导致铁中毒。七鳃鳗体内游离铁含量很高,如变态前幼体的血清铁浓度是人类正常男性的149倍,幼体肝中的铁含量约是人类正常含量的2～3倍。七鳃鳗具有完备的生物化学系统耐受体内高浓度的游离铁,铁稳态的重要基因如转铁蛋白、铁蛋白重链、超氧化物歧化酶等基因高表达,提升了铁转运、铁储存及抗氧化能力。七鳃鳗具有IRE/IRP调控系统,是适应组织内高铁环境的重要保护机制。此外,七鳃鳗在变态发育过程中逐渐形成口腔腺,成为独特的铁代谢器官。本文主要介绍了七鳃鳗各组织铁的分布及适应体内高铁含量的潜在机制,为后续寻找调控铁代谢分子机制提供理论基础。     

富含半胱氨酸分泌蛋白生物学功能的研究进展

富含半胱氨酸分泌蛋白(cysteine-rich secretory proteins,CRISPs)包含众多不同起源的蛋白质,其大部分成员功能未知。近年来研究发现,哺乳动物中的CRISP家族各成员主要存在于生殖道中,在精子的成熟、精卵融合以及免疫系统中发挥着非常重要的作用,并且其表达水平的改变与人类多种重大疾病密切相关,有望成为某些疾病理想的生物标记物和药物靶点;而非哺乳动物中的CRISP家族成员则主要存在于腺体的分泌液中,能够阻断Na+、K+、Ca2+及环核苷酸门控通道,并与炎症反应密切相关。近来,作者所在实验室从低等无颌类脊椎动物七鳃鳗的口腔腺中分离纯化出富含半胱氨酸分泌蛋白,其与CRISP家族成员具有较高的同源性。该文针对CRISP家族成员生物学功能的最新进展做了分析归纳,并指出了相关研究的发展趋势。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism