深黄被孢霉苹果酸脱氢酶基因的克隆和表达

目的 通过对深黄被孢霉（Mortierella isabellina）M6-22中MDH基因的分离鉴定,为深入了解苹果酸脱氢酶（MDH）的生理特性、结构和功能奠定基础,并进一步探讨生物体中MDH的代谢作用。方法 通过基因克隆的方法以深黄被孢霉的cDNA为模板,PCR扩增获得苹果酸脱氢酶基因MIMDH1。结果 测序结果显示该序列长990 bp,分别编码329个氨基酸。序列分析表明该序列与瓜笄霉菌（Choanephora cucurbitarum）MDH的相同性高达77%。将MIMDH1片段连接到表达载体pET32a(+)中构建重组表达质粒pET32aMIMDH1并转化至大肠埃希菌BL21中诱导表达,SDS-PAGE电泳检测在50 kD左右有一条蛋白表达条带,经镍柱亲和层析纯化和酶活分析结果显示所纯化的重组蛋白酶活高达379.28 U/mg。结论克隆的cDNA序列MIMDH1是一个新的苹果酸脱氢酶基因,所编码的蛋白具有MDH的活性。     

深黄被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因在转基因烟草中的表达

γ—亚麻酸(GLA)是人体和动物饮食中具有营养作用的重要的多烯不饱和脂肪酸,在大多数油料作物种子中不含有GLA,而只含有其前体物亚油酸,只有少数油料植物种子中含有GLA,如夜来香(Oenothera spp),琉璃苣(Borago officinalis)等。△^6—脂肪酸脱氢酶可将亚油酸转化为γ—亚麻酸,为了能够在传统的油料作物种子中产生GLA,我们将从深黄被孢霉中克隆的△^6—脂肪酸脱氢酶基因,与植物表达载体pGA643连接,构建了重组质粒pGAM—ICL6,将其通过农杆菌介导法,导入模式植物烟草中。经PCR和Southern杂交分析表明该基因已导入并整合到烟草的基因组中,Northern杂交结果表明该基因在转基因烟草的mRNA水平上获得表达。对转基因植株进行脂肪酸分析,结果显示,GLA和十八碳四烯酸(OTA)分别占总脂肪酸含量的19．7％和3．5％。     

深黄被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（GLA,C18：3△^6,9,12）是由△^6-脂肪酸脱氢酶以亚油酸（LA,C18：2△^9,12)为底物,在C6位脱氢形成的。由于在人体中,γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物,而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物,利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△^6-脂肪酸脱氢酶的cDNA,全长为1374个核苷酸,编码457个氨基酸,但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是,△^6-脂肪酸脱氢酶在其序列的N端特有细胞色素b5(Cytb5)区。这是国际上对深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。     

深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ-亚麻酸（GLA,C183△     

深黄被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（ＧＬＡ,Ｃ１８：３△６,９,１２）是由△６－脂肪酸脱氢酶以亚油酸（ＬＡ,Ｃ１８：２△９,１２）为底物,在Ｃ６位脱氢形成的。由于在人体中,γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物,而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物,利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△６－脂肪酸脱氢酶的ｃＤＮＡ,全长为１３７４个核苷酸,编码４５７ 个氨基酸,但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是, △６－脂肪酸脱氢酶在其序列的 Ｎ 端特有细胞色素 ｂ５（Ｃｙｔｂ５）区。这是国际上对深黄被孢霉△６－脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。     

深黄被孢霉Δ6—脂肪酸脱氢酶基因导入大豆

采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将深黄被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因导入大豆。从发芽5—7d的大豆菌苗切取子叶节外植体,经农杆菌浸染和共培养后,在含50mg/L卡那霉素的选择培养基上培养2-4w后,从子叶节处诱导出抗性不定芽,将不定芽转移到伸长培养基上,4-6w后长至2-3cm高的再生苗,再将再生苗切下转入生根培养基,2-6w生根,生根后的再生植株经逐渐锻炼移入花盆中,部分移栽成活的T0植株能正常开花结荚。从T0植株上收获T1种子,按株系种植。T0和T1代经PCR检测和DNA分子杂交分析,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组内并能遗传给后代。     

深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中的表达

为在传统的油料作物大豆中产生r-亚麻酸,从深黄被孢霉中克隆的△^6-脂肪酸脱氢酶基因与植物表达载体pB1121连接,构建了重组质粒pBMICL-6,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功的将该基因导人到栽培大豆吉林35、吉林43、吉林47、绥农10、绥农14和黑农37等品种中,获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析,证明外源基因已导人并整合到大豆的基因组中。Northern杂交结果表明该基因在转基因大豆的mRNA水平上获得表达。对转基因大豆种子进行脂肪酸成分分析,结果表明△。-脂肪酸脱氢酶基因获得表达,产生了r-亚麻酸,其含量最高可达27．067％,这是国内外深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中表达的首次报道。     

深黄被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中的表达

为在传统的油料作物大豆中产生γ 亚麻酸 ,从深黄被孢霉中克隆的Δ6 脂肪酸脱氢酶基因与植物表达载体pBI12 1连接 ,构建了重组质粒pBMICL6 ,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功的将该基因导入到栽培大豆吉林 35、吉林 4 3、吉林 4 7、绥农 10、绥农 14和黑农 37等品种中 ,获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析 ,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。Northern杂交结果表明该基因在转基因大豆的mRNA水平上获得表达。对转基因大豆种子进行脂肪酸成分分析 ,结果表明Δ6 脂肪酸脱氢酶基因获得表达 ,产生了γ 亚麻酸 ,其含量最高可达 2 7 0 6 7% ,这是国内外深黄被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因在大豆中表达的首次报道     

深黄被孢霉M6-22△6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

应用PCR技术,从含有深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pTMICL6中,扩增出1.38kb的目的片段,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMID6,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSc1中,在SC-Ura合成培养基中,选择到酵母工程株YMID6.在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体.通过GC-MS对酵母工程株所含的全部脂肪酸进行色谱分析,结果表明,γ-亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的8.69%.     

丝状真菌深黄被孢霉RNA的提取方法

本文在一步法的基础上,提出了一种适合于富ＲＮａｓｅ和多糖的丝状真菌的ＲＮＡ提取方法,该方法可得到完整,均一的ＲＮＡ样品,且简化了操作,同时建立起一套快速有效的ＲＮＡ样品质量检验的方法。     

甘蔗细胞质型苹果酸脱氢酶基因的克隆及其表达分析

对甘蔗(Saccharum officinarum L.)叶片全长cDNA文库进行测序,获得了1个细胞质型苹果酸脱氢酶(cMDH)基因的全长cDNA序列,命名为Sc-cMDH。生物信息学分析表明,该基因全长1314 bp,开放阅读框为999 bp,编码332个氨基酸。Sc-cMDH与其他植物cMDH的氨基酸序列同源性高达86.5%～97.0%。Sc-cMDH包含典型的NAD+结合基元T11GAAGQI17和催化基元I184WGNH188,还有相当保守的6个半胱氨酸残基,因此推断该基因为细胞质型NAD-MDH。定量PCR分析结果表明,该基因在甘蔗叶片和根中的表达量高于茎。     

高山被孢霉亚甲基四氢叶酸脱氢酶的克隆、表达和功能鉴定

叶酸代谢途径中的亚甲基四氢叶酸脱氢酶（MTHFD）可将5,10-亚甲基四氢叶酸氧化为5,10-甲炔基四氢叶酸,此过程会生成NADH或NADPH。对高山被孢霉中的MTHFD基因进行克隆、表达和功能鉴定,可进一步阐明脂质合成所需还原力NADPH的来源。首先对MTHFD序列进行分析,并以pET28a（+）质粒为载体构建了MTHFD的表达载体,然后转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。进一步利用Ni金属螯合层析纯化目的蛋白,采用比色法分析酶反应产物,表明纯化蛋白质具有MTHFD活性。高山被孢霉MTHFD对NAD⁺和NADP⁺均具有催化能力,但更偏好于将NADP⁺转化为NADPH。最后对高山被孢霉进行发酵培养,发现MTHFD的转录水平在脂质开始积累后发生了明显的上调,表明MTHFD在高山被孢霉脂质合成过程中发挥重要作用,很可能是脂质合成所需NADPH的关键来源。这为对高山被孢霉进行分子改造,使之成为高产各种多不饱和脂肪酸的细胞工程提供了理论依据。     

黑暗链霉菌中新脱氢酶基因的克隆与功能初步研究

S.tenebrarius H6主要产生安普霉素、氨甲酰妥布霉素和氨甲酰卡那霉素B,其中后两者仅在3′位有差异。为克隆相关基因,根据已报道的aprD3、livY、gentY基因设计兼并性PCR引物,并采用SON-PCR(singleoligonucleotide nested PCR)方法和LASP-PCR(linear amplification single primer PCR)方法,扩增获得部分SCD1基因,Blast分析为短链脱氢酶基因。采用基因阻断技术,使S.tenebrariusH6中SCD1基因失活。与野生菌株相比,变株的抗生素组分和含量几乎没有变化,但变株产孢子能力下降,且产孢子时间推迟,推测该基因与孢子的生成调节相关。     

南蛇藤脯氨酸脱氢酶基因的克隆和表达特性

利用兼并性引物和RACE方法, 在南蛇藤(Celastrus orbiculatus)中克隆了1个脯氨酸脱氢酶基因, 并命名为NstProDH1。序列比对显示该基因与拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum)的脯氨酸脱氢酶(ProDH)具有很高的同源性。酶学特性分析表明该酶具有脯氨酸脱氢酶的活性。比较南蛇藤不同器官该基因的转录表达模式与脯氨酸脱氢酶活性, 结果显示两者之间没有明显的关联, 说明该基因的表达受到转录和翻译水平的双重调控, 同时也暗示南蛇藤中还存在其它的脯氨酸脱氢酶基因。NstProDH1基因的表达模式与野生型拟南芥中的ProDH1具有相似性, 因此推测NstProDH1基因可能在功能上与拟南芥ProDH1基因相似。     

一类依赖于NAD的玉米胞质型苹果酸脱氢酶基因的克隆及其序列分析

苹果酸脱氢酶普遍存在于各种生物中,它负责催化草酰乙酸和苹果酸之间的相互转换.根据其辅酶的特异性和在细胞内的分布及其生理功能的不同,苹果酸脱氢酶在高等植物中可以区分出不同的类型,依赖于NAD的细胞质型苹果酸脱氢酶是其中研究较少的一类.根据已发表的其他高等植物的依赖于NAD的胞质型苹果酸脱氢酶基因的保守序列,运用SMART RACE RT-PCR技术,从玉米叶片中分离了cyMDH 的1 264 bp全长cDNA序列,通过生物信息学分析发现,该序列含有一个999 bp的完整的开放阅读框,其共编码332个氨基酸(GenBank登陆号 EU625276).序列联配与树状分析结果表明,该玉米cyMDH 序列与多个物种的cyMDH 基因具有高度的同源性.组织特异性表达分析显示MDH基因在玉米叶片中表达量最高,在茎、根中亦有低水平表达.本研究将为更深入的研究玉米cyMDH 基因的分子调控机理奠定基础.     

S-扁桃酸脱氢酶基因的克隆及表达

S-扁桃酸脱氢酶能够选择性催化S-扁桃酸生成苯甲酰甲酸。通过PCR扩增获得Pseudomonas p utida NUST的S-扁桃酸脱氢酶全长基因(mdlA),并构建了表达载体pET30a(+)-mdlA,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)后,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导获得表达,SDS-PAGE结果显示表达蛋白为43kDa。所以工程菌细胞具有转化S-扁桃酸生成苯甲酰甲酸能力。     

金针菇谷氨酸脱氢酶基因的克隆及原核表达

利用简并引物和RT-PCR方法从金针菇(Flammulina velutipes)幼嫩子实体中克隆获得FvGDH全长cDNA序列.构建入门载体pGWC-FvGDH,利用Gateway克隆技术的LR反应构建原核重组表达载体pDESTl7-FvGDH,转化大肠杆菌BL21(DE3).通过IPTG法诱导表达融合蛋白并进行表达条件优化.SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,融合蛋白相对分子质量约为53 kD,与预测的一致.最佳表达条件为温度30℃、IPTG浓度0.4mmol/L、诱导4 h.融合蛋白表达量较高,实现了FvGDH的高效表达,并利用Western blotting对其特异性进行鉴定.FvGDH基因高效原核表达体系的成功建立,为进一步研究FvGDH的酶促动力学奠定了基础.     

深黄被孢霉中微生物油脂的提取工艺

采用微波细胞破胞法处理深黄被孢霉,并对破胞后的菌体进行甲醇萃取油脂过程的研究。通过测量细胞内蛋白质释放量,确定微波处理的较佳条件为微波强度420 W,反应2 min。对微波后菌体进行扫描电镜观察,菌丝出现孔洞和裂纹,结构完全被破坏,达到微波破胞的效果;再直接进行甲酯化反应,通过正交试验考察固液比、反应温度、KOH浓度以及反应时间对甲酯化得率的影响。结果表明微生物油脂甲酯化的最佳条件:固液比(g/mL)1∶5,温度50℃,KOH-甲醇质量分数2.5%,时间2 h,此条件下干菌含油率为51.3%。     

香蕉肉桂醇脱氢酶基因的克隆及表达分析

肉桂醇脱氢酶(CAD)在木质素合成过程中起关键作用。通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从香蕉根系cDNA均一化全长文库中获得一个肉桂醇脱氢酶基因,命名为MaCAD1(GenBank登录号为KF582533)。MaCAD1是香蕉MYB基因编码框全长cDNA,包含一个1 077bp的最大开放阅读框(ORF),编码358个氨基酸。蛋白质序列同源比对发现,其含有完整的醇脱氧酶的典型保守结构域,属于典型的CAD蛋白。系统进化树比对分析表明,MaCAD1与水稻OsCAD6(CAD39907)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明MaCAD1基因组成型表达于香蕉各个组织。在耐病和感病品种中,MaCAD1均上调表达,但在耐病品种中MaCAD1在所有时间点相对于对照增加的倍数均高于感病品种,表明MaCAD1基因在香蕉的抗病性中起着重要作用,MaCAD1可以作为一个新的响应枯萎病侵染的标记基因。