循环肿瘤DNA突变检测方法研究进展

循环肿瘤DNA(Circulating Tumor DNA,ctDNA)含有肿瘤的遗传信息,与肿瘤组织具有高度的一致性,可代替肿瘤组织用于肿瘤的早期诊断,预后监测和药物疗效监测,是一种具有良好临床应用前景的液体活检标记物。但血液中的ctDNA片段化程度高,含量稀少,且与野生型DNA混合存在(约1%甚至更低),并会随着患者肿瘤分期等情况动态变化,造成了ctDNA检测困难,需要高灵敏度高特异性的突变检测方法,才能够从大量的野生型DNA中检测出微量突变型ctDNA。目前,灵敏度和特异性能够满足ctDNA检测需求的方法主要有扩增阻滞突变系统PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR,ARMS-PCR)、钳制PCR(Clamping-PCR)、数字化PCR(Digital-PCR)、西格诺公司的质谱分辨技术(Sequenom UltraseekTM)和高通量测序技术。本文对这些方法的原理、特点、最新进展和应用前景进行了综述,为研究人员选择合适的ctDNA检测方法提供理论依据。     

癌症液体活检新思路：数字PCR检测DNA甲基化

癌症的早期诊断可提高患者生存率.微创采集人体体液的液体活检方法可避免传统肿瘤组织活检方法侵入性和异质性的问题,逐渐成为癌症诊断的新方式.另外,DNA甲基化作为预测癌症发生发展的标志物,引起了越来越多研究者的关注.但传统DNA甲基化的检测方法灵敏度不高,且容易出现假阳性.近年来,数字PCR技术因其超高的检测灵敏度和精确度、无需标准曲线即可进行核酸绝对定量检测的优势,被用于DNA甲基化的定量检测中.本文首先介绍了DNA甲基化与癌症发生发展的关系,总结了传统DNA甲基化检测方法及其在癌症临床诊断中的应用,阐述了基于不同核酸样本分散方法的数字PCR技术及其在微量DNA甲基化检测中的优势,总结了采用数字PCR技术检测癌症患者体液中DNA甲基化的具体步骤,列举了数字PCR技术在癌症DNA甲基化检测中的研究成果及应用进展,最后提出了数字PCR技术检测癌症DNA甲基化未来可能面临的挑战,并对数字PCR技术在癌症液体活检方面的应用前景进行了展望.     

基于锁核酸及等位位点特异性扩增技术的KRAS基因突变检测荧光定量PCR方法研究

基于等位位点特异性扩增的原理,设计锁核酸修饰KRAS基因突变特异性扩增引物,结合封阻探针技术,建立检测KRAS基因突变的荧光定量PCR方法。结果发现,锁核酸修饰的引物及探针可显著提高等位位点特异性扩增技术用于复杂样本中的微量基因突变检测的敏感度,该技术检测KRAS基因突变的敏感性可达0.01%~0.1%。进一步用建立的荧光定量PCR方法检测52例结直肠癌患者血浆标本,并用DNA测序法作为对照,同时用健康人血浆标本建立阴性检测结果判读标准,以初步评价该方法应用于循环DNA中KRAS基因突变检测的可行性。结果发现结直肠癌患者KRAS基因突变主要是G12C、G12A和G12R,而且q PCR法的阳性检出率为46.15%,高于DNA测序法(13.46%),阴性结果与DNA测序法的符合率为100%。此外,结直肠癌患者外周血KRAS基因的突变检出率与文献报道组织标本中的突变检出率及常见突变类型基本相符。上述结果说明该方法检测循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ct DNA)具有较高的可靠性,可以用于肿瘤患者循环血液中KRAS基因突变的检测。     

头颈部肿瘤基因组中HPV16DNA的同源序列

利用头颈部肿癌临床活检新鲜组织和石蜡包埋组织的两种处理标本,分别采用核酸分子杂交和聚合酶链反应(PCR)两种技术,分析了头颈部肿瘤组织基因组中人乳头瘤病毒16型的同源序列,并研究HPV16的感染同头颈部肿瘤发生发展的关系。结果表明:1.喉鳞状细胞癌DNA中有HPV16 DNA同源序列,检测频率在20.0％以上。2.PCR扩增石蜡包埋肿瘤组织DNA中HPV16的URR(病毒基因上游调控区)中的序列,电泳分析扩增产物在喉乳头状瘤、喉癌、鼻腔内翻性乳头瘤和口腔癌中检测率分别是11.1％、20.0％、42.9％和27.3％。3.研究表明HPV16 DNA阳性率与喉癌原发部位,分化程度和临床分期之间可能有一定的相关性。人乳头瘤病毒可能是头颈部肿瘤的病毒病因之     

聚合酶链反应在研究DNA多态性中的应用

聚合酶链反应(Polymerase chain reaction PCR)是一种体外DNA扩增技术,自1985年Saiki等首次报道PCR方法以来,PCR技术迅速发展,并已广泛应用于生命科学各个方面。如基因克隆、遗传病的诊断、传染病的诊断、癌基因的检测等,由于PCR技术特异性强,扩增效率高、快速、录敏,且能克服限制性片段长度多态性(RFLP)的局限性,因此,它被有效地应用于研究DNA多态性。     

单分子PCR技术及其应用

常规PCR技术大都以大量DNA分子(一般为105个以上)为模板进行DNA扩增。新近发展起来的单分子PCR技术是一种以极少量DNA分子(1、5或10个分子)为模板进行扩增的技术。在高保真度DNA聚合酶作用下,单分子PCR技术能扩增出高度一致的DNA;在低保真度DNA聚合酶作用下,单分子PCR技术又能构建出含有大量突变基因的DNA库。该将介绍单分子PCR的基本原理、实验步骤、特点及其应用。     

表观遗传学标志物在肿瘤液体活检中的研究进展

与传统组织活检相比,液体活检具有无创、实时动态监测、克服肿瘤异质性等诸多优势,是极具潜力的肿瘤早筛早诊工具。肿瘤的发生发展伴随着异常的表观遗传学的改变,如DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控等。通过液体活检检测这些表观遗传标志物的变化已被应用于肿瘤的早诊早筛、复发监测、肿瘤亚型鉴定以及对治疗反应和结果预测等方面,并展现出极大的应用前景。该文就目前表观遗传学标志物检测在肿瘤液体活检中的研究进展进行综述。     

COLD-PCR技术的原理及应用

低变性温度下的复合PCR(COLD-PCR)技术是一种新开发的PCR方法,能够从大量野生型DNA中选择性扩增低水平未知突变。该技术显著地提高了低浓度突变的检测灵敏度,已经被应用于医药的很多领域,包括肿瘤检测、产前诊断以及传染性疾病检测等。同时COLD-PCR可以与很多分子生物学检测方法结合使用,在临床诊断上具有较好的应用前景。对COLD-PCR技术做基本的介绍,并结合其在医药领域的应用进行综述。     

聚合酶链反应技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒

目的建立聚合酶链反应(PCR)技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的方法。方法提取感染REV-T和脾坏死病毒(SNV)的SPF鸡胚成纤维细胞DNA为模板,利用前病毒长末端重复序列(LTR)区引物进行扩增。采集肿瘤病鸡,以及人工感染REV 28 d后鸡肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胸腺、法氏囊等器官,进行扩增。同时将采集的脏器组织,进行HE染色和免疫组化试验(IHC)。结果REV-T感染的组织未检测出电泳条带,而SNV感染的细胞中检测到了一条300bp特异而清晰的电泳条带,而且SNV感染的鸡组织中,PCR方法检测到了特异的条带。通过HE染色和免疫组化技术观察到了肿瘤组织,肿瘤细胞的形态、分布。结论PCR检测REV更快捷,特异更好。     

开发使用DNA探针结合粒子的检体DNA浓缩法

日本合成橡胶公司和日本罗氏公司小组使用结合了DNA探针的胶乳粒子,开发了简便且高灵敏地提取、浓缩检体中的病原菌和病毒DNA的技术。与神奈川县卫生研究所病毒部部长今井光信等合作使用这项技术用AIDS患者的血液进行检测实验。结果表明,比用普通聚合酶链反应法(PCR)的检测灵敏度高数十倍。 PCR反应是用基因扩增法扩增检测对象——基因高效率地检测的方法。但是,PCR反应的试剂量限于数十微升,所以其界限为数十微升。一旦不含检测对象就检测不出来。如果使用日本合成橡胶公司和日本罗氏开发的技术,在PCR前就能浓缩标记DNA(约330倍),据说在1ml血液中有1个分子,使用PCR