人巨细胞病毒磷蛋白65及糖蛋白B在大肠杆菌中的高效表达、免疫原性研究及初步应用

实验成功的构建了含有pp65与gB主要抗原决定簇基因的表达质粒pET-pp65、pET-gB;表达产物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹、间接酶联免疫等一系列鉴定试验进行了分析。表达蛋白经初步纯化后免疫BALB/c小鼠,经0、2、4周免疫三次,免疫后2、4、6周眼眶采血收集抗血清,进行中和试验和ELISA检测。动物试验表明两种表达蛋白具有免疫原性,并可在小鼠体内诱导产生特异性抗体,其中用重组gB蛋白免疫小鼠后得到的抗血清在体外试验中能抑制天然病毒感染细胞。同时将这两种表达蛋白作为诊断用抗原,对临床94份血清进行检测,证实pp65具有较好的特异性,为今后研制HCMV诊断试剂提供了科学依据。     

人巨细胞病毒gH蛋白表达及其单克隆抗体的制备

人巨细胞病毒(HCMV)是全球范围内普遍感染的一种疱疹病毒,也是引起胎儿先天性畸形和器官移植受者死亡最常见的病原体。有研究表明,gH蛋白是HCMV主要的中和性抗原,特异性抗gH抗体具有中和HCMV及阻断病毒在细胞间传播的潜力。本研究以含人巨细胞病毒临床株Toledo全基因组的细菌人工染色体(BAC)为模板,扩增去除信号肽和跨膜区的gH基因片段,并将其插入表达载体构建pET32a'-gH重组表达质粒,将序列鉴定正确的重组质粒转化进入表达菌株TransB,诱导重组蛋白表达。用纯化的重组gH蛋白免疫8周龄BALB/c雄鼠,经杂交瘤技术获得5株稳定分泌抗gH单克隆抗体的细胞株,分别命名为8A9、8B4、8C4、8D9、8D12。所获5株单克隆抗体对gH蛋白均具有良好的反应性,其中8A9、8B4、8D9和8D12具有一定的病毒捕获能力,且8D9和8D12的捕获能力较强。本研究获得了具有自主知识产权的抗gH单克隆抗体,抗体具有良好的病毒捕获能力。在此基础上,我们将进一步鉴定其是否为中和抗体,为今后开发治疗HCMV感染的中和抗体奠定基础。     

应用噬菌体展示技术筛选人巨细胞病毒糖蛋白M新的中和抗原表位

人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白复合物Ⅱ包括两种蛋白,即糖蛋白M(gM)和糖蛋白N(gN)．尽管来自于HCMV阳性病人血清中的糖蛋白复合物Ⅱ的IgG抗体能够中和HCMV粒子,但迄今为止,还没有gM中和性抗原表位的相关研究．应用消减杂交技术,通过噬菌体肽库筛选获得gM抗原的一个表位,即MAD．MAD氨基酸序列与gM第32～38位序列高度同源．将MAD与钥孔血蓝蛋白偶联免疫小鼠可产生抗MAD多抗,该多抗不仅结合天然HCMV病毒粒子,而且特异结合重组表达的gM30～78多肽．ELISA结果表明MAD能够特异结合HCMV阳性的病人血清．病毒中和实验结果进一步证明抗MAD多抗能够抑制HCMV AD169株病毒感染人胚肺细胞．总之,MAD表位有可能成为HCMV病毒疫苗潜在的保护性抗原.     

单克隆抗体酶联免疫吸附法检测尿标本中人巨细胞病毒抗原

本文运用抗人巨细胞病毒(HCMV)包膜20KD或/和130KD结构蛋白的单克隆抗体分别建立了4类酶联免疫吸附试验(ELISA)夹心法,共对44人份临床尿标本进行HCMV抗原检测。方法的敏感度可高达10.3—32.8ng HCMV抗原/ml尿,与尿标本中的HSV-Ⅰ、HSV-Ⅱ和EBV抗原无交叉反应,重复性良好,与病毒分离比较,敏感性和特异性在71—83％和88—100％之间;与核酸杂交比较,敏感性和特异性也可分别高达60—100％和83.3—100％。混合使用多种单克隆抗体作为包被抗体会得到较好的技术参数。上述结果提示运用单克隆抗体ELISA将有助于一般临床实验室对HCMV感染的快速诊断。     

降钙素原的原核表达及单克隆抗体制备

目的:高效表达与纯化可溶性重组人PCT蛋白,制备高灵敏度和高特异性的抗人PCT医用诊断单克隆抗体。方法:大肠杆菌表达重组人PCT蛋白后,利用饱和硫酸铵沉淀和亲和层析方法纯化PCT蛋白后,经质谱、Western blot和间接ELISA法进行性质鉴定和分析重组蛋白的表达与免疫反应性;重组蛋白免疫小鼠,经细胞融合及筛选制备抗PCT单克隆抗体(m Ab)。结果:在大肠杆菌中高效表达了人PCT蛋白;重组人PCT蛋白具有良好的免疫反应性与免疫原性;经筛选获得7株抗PCT单克隆抗体细胞株,经ELISA鉴定,筛选抗体可与PCT抗原有良好的特异性反应。结论:利用重组人PCT蛋白免疫制备了抗人PCT单克隆抗体,为进一步研发PCT快速诊断试剂提供了原料。     

人巨细胞病毒pp65蛋白的原核表达及活性鉴定

以病毒全基因组为模板,通过PCR技术扩增HCMV pp65基因编码序列,其产物连接到pMD18-T质粒,酶切并回收目的片段后克隆到表达载体pTO-T7,然后将重组质粒pTO-T7-pp65转化大肠杆菌ER2566,大量表达后将重组蛋白进行质谱法分析鉴定,再利用Western blot以及间接ELISA进行重组蛋白的活性及抗原性鉴定.结果显示:通过SDS-PAGE鉴定可知,大肠杆菌可能表达出了重组蛋白,质谱分析结果说明了重组蛋白为pp65蛋白,具有极高可信度,其相对分子质量约为63 kD,从Western blot和间接ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)的结果可知,pp65蛋白作为抗原具有良好的免疫反应性与免疫原性,为制备相应的抗原诊断单克隆抗体打下了基础,同时也为开发HCMV IgG快速诊断ELISA试剂盒提供了可选原料.     

人巨细胞病毒IE1蛋白功能研究进展

人巨细胞病毒(HCMV)在人群中多数呈隐性感染,但对免疫功能低下者可引起严重的疾病甚至死亡。HC-MV IE1蛋白为一种多功能调节蛋白,是HCMV感染后表达最早且表达量最丰富的蛋白,它可影响病毒和细胞启动子的转录活性,调控HCMV基因的时序性表达,并通过参与不同的信号转导通路,在细胞中发挥促进凋亡或抑制凋亡作用,IE1蛋白与HCMV在体内持续性感染以及肿瘤的形成密切相关。     

巴泰病毒单克隆抗体的制备及鉴定

巴泰病毒(Batai virus,BATV)是一种人兽共患病毒,近年在全球广泛流行。我国也有人和动物感染的相关报道,而目前对BATV的研究仅局限于分子检测和全基因测序,还没有关于BATV单克隆抗体的相关研究,但制备特异性强、活性好的单克隆抗体也是防控BATV的关键。为了制备BATV单克隆抗体,本研究利用纯化的BATV作为抗原免疫雌性BALB/c小鼠,制备鼠源单克隆抗体。通过免疫小鼠后断尾取血,间接ELISA测其血清效价后,将SP2/0细胞与小鼠的脾细胞融合。ELISA方法筛选阳性细胞株,并进行亚克隆后制备单抗腹水,并利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水。结果获得7株单克隆抗体,包括5株IgG型和2株IgM型。其中制备的3E2单克隆抗体效价最高为1∶32 000。经间接ELISA、间接免疫荧光和Western Blot检测表明,制备的3E2单抗具有较好的纯度、活性和特异性,为BATV快速检测方法的建立及致病机制研究奠定了基础。     

登革病毒交叉反应性单克隆抗体的制备及特异性研究

近年来全球登革疫情严峻,而针对登革疫苗的研究一直进展缓慢,尚无有效的疫苗或治疗性药物,被动免疫逐渐成为研究热点。本研究旨在通过制备登革病毒(Dengue virus,DENV)交叉反应性单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)并鉴定其特异性,期望为登革病毒的被动免疫治疗及疫苗的研发提供一定的物质基础和参考。本研究采用4种DENV联合免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,采用有限稀释法对阳性孔细胞进行筛选,获得DENV交叉反应性mAb。采用腹水诱生法对其中的一株mAb进行了大量制备和纯化,鉴定其Ig亚类,通过间接法酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测了mAb对4种血清型DENV的有效滴度,通过间接免疫荧光试验(Immunofluorence assay,IFA)和蛋白质印迹(Western Blot,WB)对其特异性进行鉴定,通过噬斑减少中和试验(Plaque reduction neutralization test,PRNT)检测了mAb的中和能力。结果显示成功获得3...     

Derivation of Neutralizing Monoclonal Antibodies Against Rotavirus

Monoclonal antibodies were derived against the SA11 simian, NIC bovine, and Wa human rotavirus strains and characterized by enzyme-linked immunosorbent assay, plaque neutralization, and hemagglutination inhibition. Several strain SA11-specific antibodies were found to have neutralizing and hemagglutination-inhibiting capacity.     

人乳头瘤病毒（HPV）58型中和单克隆抗体的制备及初步应用

人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）58型是宫颈癌的主要诱因之一. HPV58在亚洲地区宫颈癌组织中的检出率仅次于HPV16/18. HPV58中和单克隆抗体可用于 HPV病毒样颗粒（virus-like particle,VLP）疫苗的研究,并为病毒感染入侵机制的 研究提供实验材料. 本研究采用HPV58 L1 VLP免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞进行杂交瘤 细胞的制备,通过VLP-ELISA和假病毒中和实验筛选杂交瘤细胞株;经rProtein A纯化 阳性杂交瘤细胞培养上清获得单抗;采用ELISA测定型别特异性中和单抗的亲和力,采用相加实验及变性VLP-ELISA分析单抗识别表位的性质;选取高亲和力单抗建立定量分 析HPV58 L1 VLP的ELISA方法. 获得了2株HPV58特异性中和单抗XM-22和XM-23,亲和常数分别为2.7×107 mol-1·L和1.9×106 mol-1·L,二者识别表位可能不同. 同时获得2株具有交叉中和活性的单抗XM-21和XM-24,除可较高水平中和HPV58外,还可分别交叉 中和亲缘关系较远的HPV18和HPV6. 以XM-22建立的ELISA方法定量分析HPV58 L1 VLP的检测范围为0.05 μg/mL~0.40 μg/mL. 本研究建立的ELISA方法可用于HPV58 L1 VLP疫苗生产的质量控制研究,获得的4株具有不同特点的中和单抗可用于HPV58感染入侵机制 的研究.     

SARS-CoV单克隆抗体的制备及抗原表位的初步鉴定

参照已发表的SARS冠状病毒BJ01株基因序列 ,利用计算机软件预测并选取该病毒S、M、N三种主要结构蛋白部分抗原性优势区域 ,以编码Gly-Pro-Gly序列相连接合成两段嵌合基因A和B。并分别克隆于pGEX -6p- 1载体上用IPTG进行诱导表达 ,以纯化的嵌合蛋白A和B为抗原 ,分别免疫BALB c小鼠制备单克隆抗体。利用单克隆抗体亚型检测试剂盒和SARS CoV商品化ELISA检测试剂盒对其进行亚型和特异性鉴定。结果表明融合表达两段嵌合基因产物 ,其大小分别为 34kD和35kD ,Westernblot分析证实两种表达产物都能被SARS病人康复期血清所识别。获得了 6株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞克隆株。亚型鉴定结果除D3C5为IgG2a外其他单抗均为IgG1,而且所有单抗的轻链均为κ链。特异性鉴定发现除D3D1外 ,其余的 5株单抗均能与SARS CoV商品化ELISA检测试剂盒发生特异性反应。将D3D1与灭活后经超声波裂解的SARS CoV进行Westernblot分析 ,发现它能特异性识别 180kD的蛋白带。分别融合表达了 6个S蛋白的寡肽 (S1- S6 ) ,并对筛选出的单克隆…     

抗HCMV Pp65蛋白单克隆抗体的制备及性质研究

人类巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）是一种机会性感染疱疹病毒,在人群中感染比较常见,但在免疫缺陷个体与新生儿中可引起严重的疾病。HCMV Pp65是HCMV活动感染的主要标志,也是临床检验检测HCMV感染的重要靶标。为研发抗HCMV Pp65蛋白单克隆抗体作为临床免疫检测HCMV感染的关键原料,本研究采用重组表达的HCMV Pp65蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠淋巴结细胞与sp2/0细胞融合,采用间接ELISA法筛选阳性克隆与效价测定,再用Western blotting进行抗体特异性鉴定,最后用免疫捕获PCR和免疫荧光法评价其应用前景。最终获得了1株能稳定分泌高效价的抗HCMV Pp65单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为8D6。Western blotting及间接ELISA检测其效价分别达1∶4 000和1∶105;细胞免疫荧光与免疫捕获PCR实验结果说明,该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有良好的亲和力和特异性,具有作为外周血细胞免疫荧光细胞化学和免疫捕获PCR检测HCMV临床感染的关键原料,也可作为双抗体夹心法检测HCMV临床感染的关键原料,为建立HCMV感染快速灵敏的临床诊断试剂打下了重要的基础。     

抗人肌糖蛋白C单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗人肌糖蛋白C(tenescin-C,TN-C)单克隆抗体并鉴定.方法:根据人TN-C蛋白序列,用软件预测B细胞表位;化学合成优势表位蛋白肽,分别与钥孔戚血蓝素(KLH)和兔血清白蛋白(RSA)交联;取KLH-TN-C常规免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合,用分别预包被KLH-TN-C或者RSA-TN-C融合蛋白的ELISA板筛选高亲和力单克隆抗体;取骨肉瘤组织进行免疫组化染色.结果:获得蛋白优势表位数据;成功将TN-C肽交联至KLH和RSA;获得3株抗人TN-C单克隆抗体,分别为IgG1和IgG2a亚型,腹水效价为10-6左右,免疫组化有阳性着染.结论:成功获得抗人TN-C单克隆抗体.     

重金属锌单克隆抗体的制备及鉴定

通过双功能螯合剂S-20-(4-异硫氰苄基)-二乙烯三胺五乙酸(p-SCN-Bn-DTPA)将锌离子(Zn2+)分别与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)和牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)偶联.通过二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法测抗原蛋白浓度,对抗原、KLH和BSA分别进行紫外分光光度计扫描,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)进行定性鉴定,利用石墨炉原子吸收分光光度法检测抗原中Zn2+含量等,成功获得了免疫抗原Zn-DTPA-KLH和检测抗原Zn-DTPA-BSA、DTPA-BSA.用Zn-DTPA-KLH免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合,极限稀释法亚克隆,间接酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)筛选,获得了1株稳定分泌抗重金属锌抗体的杂交瘤细胞株(Z1A5).Z1A5染色体数目在100以上,所分泌的抗体为IgM亚类,轻链为kappa型,腹水型抗体效价高达1∶51 200.本研究为锌离子残留免疫学检测方法的建立提供了物质及技术基础,对提高风险评估工作的效率和质量,保障食品安全有重要现实意义.     

Preparation of Novel Monoclonal Antibodies Against Chelated Cadmium Ions

The detection of cadmium ions using enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) has been reported by several research groups. Because cadmium ions are too small to stimulate the immune system, high molecular weight immunogens of cadmium are constructed using bifunctional chelators. At present, the most commonly used bifunctional chelator for the preparation of antigens for heavy metal ions is 1-(4-isothiocyanobenzyl) ethylenediamine N,N,N′,N′-tetraacetic acid (ITCBE). However, the price of ITCBE is high. So we are interested in a cheaper bifunctional chelator, 1-(4-aminobenzyl) ethylenediamine N,N,N′,N′-tetraacetic acid (aminobenzyl-EDTA). Here, cadmium ions were conjugated to carrier proteins using aminobenzyl-EDTA to make artificial antigens. Then, several mice were immunized with the antigen. And monoclonal antibodies (MAbs) against cadmium were produced. Spleen cells of immunized mice were fused with myeloma cells. The resulting hybridomas were screened using protein conjugates which were covalently bound to metal-free EDTA or cadmium. Three hybridoma cell lines (A3, E4 and B5) that produced MAbs with high selectivity and sensitivity were expanded for further study. Cross-reactivities with other metals were below 1 %. These antibodies were used to construct competitive ELISAs. The IC₅₀ for A3 was 8.4 μg/l. The detection range and the lowest detection limit using the antibody A3 was 0.394–64.39 and 0.051 μg/l, respectively. Spike–recovery studies in tap water showed that the antibody A3 could be used for cadmium detection in drinking water.     

小鼠抗食蟹猴IgG单克隆抗体的制备

目的制备抗食蟹猴、恒河猴等非人灵长类实验动物免疫球蛋白二级抗体,开展对其传染病血清学快速诊断方法的建立。方法采用饱和硫酸铵盐析、Agarose-Protein G亲和层析技术,从食蟹猴血清中提纯IgG。经SDS-PAGE电泳鉴定,采用常规法免疫C57BL/6小鼠,三次免疫后取脾细胞与Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞通过PEG4000融合制备杂交瘤细胞,利用间接ELISA、Western blot等方法进行筛选、鉴定。结果得到5株阳性杂交瘤,分别命名为2B6、2B7、2D9、3B2、5E4,并且5株杂交瘤分泌的抗体均与恒河猴的IgG或血清发生交叉反应,而与其他物种如东北虎、犬等动物的IgG或血清无交叉反应。结论 5株杂交瘤产生的单克隆抗体（McAb）具有较好免疫活性,且能长期、稳定地分泌抗体。此项研究工作为后续研究食蟹猴、恒河猴传染病血清学诊断方法奠定基础。     

6种沙门菌单克隆抗体的制备和效能评价

目的：制备稳定、特异、高亲和性的分别针对甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的单克隆抗体。方法：用甲醛灭活的菌液抗原免疫BALB／c小鼠,取脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合;用灭活的菌液包被酶标板,ELISA筛选阳性克隆株,建立细胞系;选取高效分泌杂交瘤细胞,常规制备腹水并纯化,进行单抗特异性与亲和性评价。结果：筛选得到分泌6种沙门菌相应单克隆抗体的杂交瘤细胞株,获得高亲和性单抗;所有单抗与大部分病原菌（包括7种沙门菌、3株志贺菌、2株李斯特菌、4株致病性大肠杆菌、2株霍乱弧菌）无交叉反应,但由于同类型O抗原的广泛分布,抗乙型副伤寒沙门菌单抗与鼠伤寒沙门菌、抗伤寒沙门菌单抗与肠炎沙门菌有明显的交叉反应。结论：沙门菌单抗的制备,为感染性腹泻的监测、诊断奠定了基础。