稀有密码子对proUK基因在大肠杆菌中高表达的影响

ＡＧＧ／ＡＧＡ密码子在ｐｒｏＵＫ基因中出现的频率高达２％,大肠杆菌中现有的编码ｔＲＮＡＵＣＵ的ａｒｇＵ基因不能满足ｐｒｏＵＫ高表达的需要。本文研究了ａｒｇＵ基因剂量对ｐｒｏＵＫ表达的影响,结果表明带有ａｒｇＵ基因的中等拷贝数质粒能促进ｐｒｏＵＫ基因表达。     

稀有密码子对proUK基因在大肠杆菌中高表达的影响

AGG/AGA密码子在proUK基因中出现的频率高达2%,大肠杆菌中现有的编码tRNA UCU的argU基因不能满足proUK高表达的需要。本文研究了argU基因剂量对proUK表达的影响,结果表明带有argU基因的中等拷贝数质粒能促进proUK基因表达。     

人β神经生长因子基因稀有密码子及mRNA二级结构对其在大肠杆菌中表达的影响

目的:研究人β神经生长因子(β-NGF)基因中稀有密码子及其mRNA二级结构对其在大肠杆菌中表达量的影响。方法:根据对人β-ngf中稀有密码子及其mRNA二级结构的研究,同义突变人β-ngf基因,通过PCR得到人β-ngf的5’端同义突变基因rh-β-ngfp32和全同义突变基因rh-β-ngfmu,将这2个序列克隆入载体pET3a中,得到重组质粒pET3a-ngfp32和pET3a-ngfmu,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,IPTG诱导表达,收集菌体,SDS-PAGE检测其表达量的改变。结果:构建的pET3a-ngfp32和pET3a-ngfmu表达载体酶切和测序结果正确,SDS-PAGE结果显示,与在重组菌pET3a-NGF总蛋白中的表达量相比,目的蛋白rh-β-NGF在重组菌pET3a-NGFP32和pET3a-NGFmu中的表达量均明显增高,并且在重组菌pET3a-NGFmu中的表达量高于重组菌pET3a-NGFP32。结论:目的蛋白rh-β-NGF在重组菌pET3a-NGFP32和pET3a-NGFmu中表达量的增高,说明人β-ngf基因中稀有密码子和mRNA的二级结构对其在大肠杆菌中的表达有较为明显的影响,结果为构建rh-β-NGF的大肠杆菌工程菌株奠定了基础。     

Mx基因稀有密码子和mRNA结构及大肠杆菌表达 优化

通过对稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构的分析, 构建了4种重组表达菌株BL21(DE3)/pET-Mx, Rosseta(DE3)/pET-Mx, BL21(DE3)/pGEX-Mx和Rosseta(DE3)/pGEX-Mx, 在大肠杆菌中进行Mx基因的表达, Rosseta(DE3)/pET-Mx和Rosseta(DE3)/pGEX-Mx重组表达菌中都获得了表达, Western blotting检测到了特异的75 kDa表达产物。实验结果证明稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构对Mx 蛋白表达都有影响, 选择适用于稀有密码子表达的菌株Rosetta(DE3)有利于Mx蛋白的表达, 同时翻译起始区二级结构能值较低的表达载体pGEX-Mx获得的表达量明显增高。实验中首次获得了重组表达鸡全长Mx蛋白的大肠杆菌重组菌。     

hIL—5cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

从人外周血中分离淋巴细胞,经ＰＭＡ和钙离子载体Ａ２３１８７诱导,通过ＲＴ－ＰＣＲ技术获得ｈＩＬ－５ｃＤＮＡ片段。扩增其编码成熟多肽的ｃＤＮＡ片段插入ｐＢＶ２２０,在大肠杆菌ＤＨ５α中诱导表达,未能得到预期１４ｋＤ的重组蛋白的表达,只有一个克隆高效表达约１０ｋＤ的小肽。对该克隆测序表明,其ｃＤＮＡ缺失一个Ａ,导致在８６位氨基酸处于开始移码,高效表达一个９３个氨基酸的小肽。     

hIL-5的E13Q突变体在大肠杆菌中的高效表达

白细胞介素5(IL-5)主要由Th2细胞产生,对B细胞、T细胞和嗜酸性粒细胞具有多种生物学作用。人IL 5(hIL-5)cDNA编码134个氨基酸,其成熟多肽由115个氨基酸组成。目前hIL 5 cDNA在大肠杆菌表达尚未见报道。国     

qa-3稀有密码子和mRNA结构改造及其在大肠杆菌中的高效表达

奎尼酸脱氢酶的高表达是奎尼酸生物合成的代谢工程研究的关键和基础。粗糙脉孢菌基因组中编码奎尼酸脱氢酶的基因qa-3在大肠杆菌中不表达,根据大肠杆菌密码子使用频率分析qa-3基因,发现有27个稀有密码子,其中编码Arg(R)的有8个,编码Gly(G)的有9个。编码精氨酸的AGG(AGA)两个稀有密码子紧密相连(R区),另外还有个相对比较集中的GGG密集区G区。进一步通过计算机分析其qa-3基因mRNA二级结构,发现改变5′和3′末端个别碱基对其二级结构的影响很大,可以使mRNA的自由能由野生型的-374.3kJ/mol降低到最小-80.5kJ/mol,从而大大减少mRNA两端二级结构的产生,而仅仅改变R区和G区的稀有密码子自由能变化很小。通过对该基因密码子改造和优化5′和3′末端对其mRNA二级结构的影响,在大肠杆菌中表达真菌的基因qa-3,并测到了奎尼酸脱氢酶活性,为构建产奎尼酸工程菌株奠定基础。     

稀有密码子对大肠埃希菌表达外源蛋白的影响

外源基因中的稀有密码子是影响大肠埃希菌（大肠杆菌）表达的重要因素,稀有密码子尤其是串联稀有码子能降低甚至耗竭胞内同源ｔＲＮＡ,降低蛋白表达水平,并具有显著的位置效应,另外,稀有密码子可以引起外源ｍＲＮＡ翻译过程中的移码翻译,核糖体跳跃和氨基酸错配等异常事件,本文就稀有密码子影响大肠杆菌蛋白表达的机制研究作一系统综述。     

稀有密码子影响人RNaseH-Apaf1融合蛋白原核表达

通过限制性内切酶克隆法构建两个pET-28a-TAT-RNaseH-Apaf1重组质粒,其中一个质粒经过稀有密码子的优化。将两个重组质粒分别转化原核表达宿主菌BL21(DE3)和Transetta(DE3),通过SDS-PAGE观察相应融合蛋白诱导表达的情况,并用His标签抗体和Apaf1抗体通过Western Blotting鉴定诱导蛋白。菌液PCR和测序证明经稀有密码子优化和未经稀有密码子优化的人源RNaseH-Apaf1序列成功重组到pET-28a-TAT载体中;经稀有密码子优化的重组质粒成功地在大肠杆菌宿主菌中表达RNaseH-Apaf1融合蛋白,并用Western Blotting检测到该融合蛋白。结果表明,稀有密码子可影响人RNaseH-Apaf1融合蛋白的原核表达。     

qa-3稀有密码子和mRNA结构改造及其在大肠杆菌中的高效表达

奎尼酸脱氢酶的高表达是奎尼酸生物合成的代谢工程研究的关键和基础。粗糙脉孢菌基因组中编码奎尼酸脱氢酶的基因qa-3在大肠杆菌中不表达,根据大肠杆菌密码子使用频率分析qa-3基因,发现有27个稀有密码子,其中编码Arg?的有8个,编码Gly(G)的有9个。编码精氨酸的AGG(AGA) 两个稀有密码子紧密相连（R区）,另外还有个相对比较集中的GGG密集区G区。进一步通过计算机分析其qa-3基因mRNA二级结构,发现改变5′和3′末端个别碱基对其二级结构的影响很大,可以使mRNA的自由能由野生型的-374.3 kJ/mol降低到最小-80.5 kJ/mol,从而大大减少mRNA两端二级结构的产生,而仅仅改变R区和G区的稀有密码子自由能变化很小。通过对该基因密码子改造和优化5′和3′末端对其mRNA二级结构的影响,在大肠杆菌中表达真菌的基因qa-3,并测到了奎尼酸脱氢酶活性,为构建产奎尼酸工程菌株奠定基础。     

猪Follistatin cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

提取猪卵巢总RNA,用RT-PCR方法克隆了猪FollistatincDNA的完整开放阅读框,长1038bp。将FollistatincDNA连接到原核表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导,进行了GST-FS融合蛋白表达。用SDS-PAGE和Western杂交检测,结果显示在63kD处有特异性表达蛋白。     

大肠杆菌表达的重组hIL-4的分离纯化

对大肠杆菌表达的重组人白细胞介素 4进行了分离纯化。人 IL- 4基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包含体形式存在 ,经过超声破菌、包含体抽提、洗涤处理 ,可使包含体纯度达 70 %以上 ,用 6mol/L盐酸胍变性溶解包含体沉淀后上清直接稀释复性 ,再经浓缩、透析、离子交换色谱一系列纯化步骤终产物纯度达 95 %以上 ,回收率 1 0 %以上 ,比活性达 2 .5× 1 0 6U/mg     

甘油脱氢酶基因在大肠杆菌中的密码子优化表达

[目的]利用密码子优化技术,提高甘油脱氢酶基因gldA在大肠杆菌中的表达水平.[方法]针对gldA起始密码子下游区域,优先选择AT含量最高的同义密码子,从而在不改变氨基酸序列的前提下,提高该区域的AT含量.利用大引物PCR的方法对野生型gldA-WT进行定点突变,获得优化型基因gldA-4,与pET-32a(+)连接后...     

pEASY-TAZ-5原核表达载体的构建及在大肠杆菌中表达

TAZ基因在心磷脂代谢异常导致线粒体功能障碍中起重要作用。本研究旨在构建人TAZ-5(h TAZ-5,Δ5)的基因工程菌,用乳糖诱导TAZ-5蛋白的表达,为后续h TAZ-5纯化、抗血清的制备及生理功能检测奠定基础。以h TAZ全长为材料,通过PCR方法扩增人h TAZ-5基因,将其插入到原核表达载体p EASY中。经菌落PCR筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体p EASY-TAZ-5构建成功。将p EASY-TAZ-5转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞Transetta(DE3)中,用乳糖诱导蛋白表达,分别对诱导剂浓度、时间、时机及温度等条件进行优化,确定最优的乳糖诱导条件,并对表达产物进行可溶性分析。结果表明PCR扩增出约786 bp的目的产物,与预期的片段长度一致;h TAZ-5蛋白最优表达条件为终浓度2.0 g/L乳糖、A600=0.8、37℃下诱导4 h,可以达到良好的诱导效果;收集菌体中的上清和沉淀,进行可溶性分析,目的蛋白以包涵体的形式存在。Western Blot分析表明重组蛋白TAZ表达成功。成功构建p EASY-TAZ-5原核表达载体,乳糖可诱导h TAZ-5(Δ5)基因表达,且效果很好。     

植酸酶基因中稀有密码子的改造提高其在毕赤酵母中的表达量

对来源于黑曲霉N2 5(AspergillusnigerChinaStrain)的植酸酶基因phyA进行PCR介导的定点突变 ,不改变其所编码氨基酸 ,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因保守序列中第 81位和第 85位的Arg密码子进行同义突变 .构建了含正确突变的克隆载体pUC18 phyAm 和酵母表达载体pPIC9k phyAm,电击转化毕赤酵母 ,经MM、MD平板筛选和产物的酶活性测定 ,筛选出突变与未突变高酶活酵母转化子各 2株 .这 4株转化子的Southern印迹结果表明 ,phyA基因以单交换方式单拷贝整合到酵母染色体DNA中 .表达产物的SDS PAGE分析表明 ,重组酵母中的植酸酶能有效分泌和表达 ,蛋白质分子大小为 70 15kD .转化子酶活测定结果表明 ,经密码子优化的突变重组酵母酶活力明显高于未进行优化的重组酵母转化子 .经密码子优化的突变重组酵母株PP NPm 8于麦芽汁培养基中诱导 36h后酶活力可达 4 76 0 0U/ml,其活力比未优化重组酵母株PP NP 2 (2 36 6 7U/ml)提高了约 1倍 ,且重组转化子遗传稳定性良好 .     

人工合成草鱼生长激素cDNA在大肠杆菌中的表达

经密码子优化的人工合成草鱼生长激素cDNA与表达载体pET-28a( )重组,构建重组表达质粒PET－GH。转化在肠杆菌BL21（DE3）,筛选阳性克隆,IPTG诱导表达,12．5％的SDS－PAGE分析显示,大肠杆菌表达产物中含有与草鱼生长激素分子量一致的新增蛋白带,激光密度扫描,其产量约占菌体总蛋白的40％,金属离子螯合层析柱亲和纯化,获得电泳纯的重组蛋白。Western-blotting和酶联免疫吸附受体法检测证实,重组蛋白与抗草鱼生长激素的多克隆抗体发生特异性结合;复性合的重组蛋白有与天然草鱼生长激素一致的生物学活性。     

磁场对大肠杆菌生长影响的研究

通过对在外加恒强磁场与正常情况下培养的大肠杆菌的生长曲线的测定及对比分析,发现外加磁场能影响大肠杆菌正常的生长并能使其世代周期延长。     

拟南芥SHORT-ROOT基因稀有密码子分析及其在原核细胞中的表达和纯化

目的:在大肠杆菌中重组表达拟南芥SHORT-ROOT(SHR)蛋白并纯化。方法:将SHR基因编码区克隆至p GEX-4T-2表达载体,构建重组质粒p GEX-4T-2-SHR并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),表达产物经谷胱甘肽亲和层析凝胶4B分离纯化,SDS-PAGE分析和Western印迹鉴定。结果:SHR融合蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的86×103,且经Western印迹确证。结论:获得了拟南芥SHR融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。