抗菌蛋白LCⅢ的分离纯化及其部分特性

拮抗细菌Bacillus subtills．A014培养液上清经硫酸铵沉淀后。上CM52阳离子交换层析柱,分离出的峰Ⅲ具有对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas campestris pv.oryzea)特异性抑制活性。进一步用快速液相色谱(FPLc)的Mono s层析柱纯化并命名为抗菌蛋白LcⅢ。此蛋白质的分子量约26915 Da,等电点为9．12。氨基酸组成分析表明富含甘氧酸、苏氨酸,丝氨酸,缺少脯氨酸。经：Edman降解法测出N末端28个氨基酸残基。根据其部分序列用计算机检索NBRF蛋白质文库,与所收入的已知蛋白质没有显著的同源性,表明是一种新的功能蛋白质。     

浑球红细菌谷氨酸合酶大亚单位基因(gltB)的序列分析

测定了浑球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)谷氨酸合酶大亚单位基因(gltB)及其5'端和3'端的序列,全长为5510bp。序列分析表明,R. sphaeroides gltB基因全长为4636bp。从核苷酸序列推测其蛋白质分子量约为164kD。R. sphaeroides gltB基因与Azospirillum brasilense和Escherichia coli的gltB基因DNA序列有很高的同源性。其蛋白质氨基酸序列与A. brasilense gltB基因产物GltB也具有很高的同源性。此外,还对R. sphaeroides GltB的各可能功能区进行了分析,发现它们具有很高的保守性。     

大豆中一个新防卫基因的克隆与鉴定

从大豆中分离鉴定了一个单拷贝的cDNA克隆,该基因所编码的蛋白质富含脯氨酸,命名为SbPRP .序列分析表明它具有完整的编码框,编码一个具126个氨基酸的蛋白质,其中含有一个由25个氨基酸组成的信号肽.成熟蛋白SbPRP具有典型的双模块结构,包括富含脯氨酸结构域(17个氨基酸)和一个长的疏水的富含半胱氨酸的结构域(84个氨基酸). SbPRP的表达具有明显的器官特异性,即叶中大量表达而根中不表达.Northern杂交进一步表明,SbPRP不仅对水杨酸处理作出迅速应答,而且也可对接种大豆花叶病毒Sa株系作出应答,同时还对其他非生物胁迫如盐和干旱也有明显的应答作用,因此SbPRP基因可能是一个新的防卫基因.     

灰树花多糖PGF-2的理化性质及化学结构的初步表征

本文利用仪器分析技术对灰树花多糖级分PGF-2的理化性质和化学结构进行了研究。灰树花粗多糖PGF经DEAE—Sephadex A-25柱层析分离得到一种多糖级分为糖蛋白质缀合物PGF-2,其多糖含量95.4%,纸层析及Sephadex G-200凝胶柱层析证实PGF-2为均一多糖;凝胶渗透色谱测定其数均分子量Mn为118 803 Dal,重均分子量Mw为119 612 Dal;经气相色谱分析PGF-2的糖基由葡萄糖、甘露糖和半乳糖组成,摩尔比为1:2.35:1.22;氨基酸分析结果表明PGF-2的蛋白质由16种氨基酸组成。红外光谱与核磁共振谱证实PGF-2主要存在α型糖苷键。由β-消除反应推断PGF-2中多糖与氨基酸的连接方式以-O-Ser连接。     

L-乳酸脱氢酶基因克隆及功能分析

构建了一株产D ,L_乳酸的乳杆菌 (Lactobacillussp .)MD_1的基因文库。利用乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的EscherichiacoliFMJ14 4作为宿主 ,通过互补筛选分离克隆到乳酸脱氢酶基因 (ldhL)。核酸序列分析表明 ,该基因以ATG为起始密码子编码 316个氨基酸残基组成的蛋白质 ,预测的分子量为 33 84kD ;5′端存在典型的启动子结构 ,3′端的终止子是不依赖于 ρ因子的转录终止子。ldhL编码的蛋白质有 3个保守区域 ,其中Gly13～Asp50保守区域是NADH的结合位点 ,Asp73～Ile10 0和Asn12.3～Arg15.4保守区是酶的活性部位。该ldhL和其他乳杆菌的ldhL基因和编码的氨基酸序列相似性较低 ,核苷酸序列相似性最高仅为 64.1% ,氨基酸序列相似性最高仅为 68.9% ,是新的L_乳酸脱氢酶基因     

红栓菌胞外漆酶的诱导、纯化及部分特性研究

红栓菌(pycnoporus cinnabarius)在发酵培养3d后出现胞外漆酶活性峰。木素类似物对红栓菌胞外漆酶活性有诱导作用,阿魏酸、香兰素,愈创木酚和DL-β-苯丙氨酸诱导24h后,发酵液中漆酶活性分别是对照的2.8、4.3、3.5和1.7倍。发酵液经(NH_4)_2S0_4沉淀,Sephadex G-150、DEAE-Sephadex A-25、Sephadex G-25柱层析纯化后,冷冻干燥。高效液相色谱(HPLC)检测为一单峰,分子量为26000,含17种氨基酸,氨基酸总量占酶组成的64.27％。等离子光谱(ICP)分析表明漆酶含有铜。该酶反应的最适温度为30℃,与邻联苯甲胺反应最适pH为4.0,Km值为385μmol/L;与丁香醛连氮反应最适pH为5.8,Km值为833μmol/L。     

杜氏盐藻psaB基因cDNA的克隆与序列分析

根据真核生物莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、Chlamydomonas moewusii、Chlorella vulgaris以及Mesostigma viride的psaB基因的氨基酸高度保守序列,设计一对简并引物,利用TRIzol试剂提取杜氏盐藻（Dunaliella salina）细胞的总RNA,通过RT-PCR,得到的一段长为1.8kb左右的cDNA片段。PCR产物经T-A克隆并测序分析以及测序结果推导成氨基酸序列进行同源性比较,表明所克隆的1815bp序列为杜氏盐藻psaB cDNA片段,GenBank收录号为AY820754。根据已经得到的psaB序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的psaB基因相比较,同源性分别为Chlamydomonas reinhardtii 92%,Chlamydomonas moewusii 91%,Chlorella vulgaris 86% , Mesostigma viride 85%,Physcomitrella patens subsp.Patens 85%, Nephroselmis olivacea 84%。据此可推断本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻psaBcDNA序列。     

白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶的分离纯化及性质

DEAE-SephadexA-25、Sephadex-G-100和CM-SephadexC-50三步柱层析分离法,从白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒中分离纯化出具有5′-核苷酸酶活性的组分。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量为48.03 kDa,HPLC柱层析图谱为单一峰。该组分是一个糖蛋白,以一磷酸腺苷（AMP）为底物时,其酶活力为330.33 μg Pi/（min·mg）;而以二磷酸腺苷（ADP）为底物时,其酶活力为123.56 μg Pi/（min·mg）。金属离子Zn²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺对5′-核苷酸酶活性有显著的抑制作用,EDTA可完全抑制其酶活性。该酶的最适pH为9,最适温度为50℃。该组分还具有抑制由ADP诱导的血小板聚集的生物功能。     

类大麦属高分子量谷蛋白基因Kx的序列测定及表达

利用SDS_PAGE检测了2份类大麦属(Crithopsisdelileana)材料的高分子量谷蛋白亚基组成,并对其中1份材料的x型亚基进行了克隆和测序。结果表明,2份材料具有完全相同的蛋白电泳图谱。在小麦的高分子量区域仅检测到一条蛋白质带,与小麦y型亚基的迁移率接近,但克隆测序表明其为x型高分子量谷蛋白亚基,其编码基因命名为Kx。Kx基因编码区序列长度为2 0 5 2bp ,编码长度为6 6 1个氨基酸残基的蛋白质,其序列具有典型的x型高分子量谷蛋白亚基的特征。Kx基因能在原核表达系统内正确表达,其表达蛋白与来源于种子中的Kx亚基的迁移率完全一致。Kx亚基与小麦属A、B和D ,山羊草属C和U以及黑麦属R染色体组编码的高分子量谷蛋白亚基氨基酸序列非常相似,但在N和C保守区的氨基酸组成以及重复区长度上与它们存在明显差异。聚类分析可将Kx与Ax1聚类为平行的分支。由此可见,来源于C .delileana的Kx基因为一新的x型高分子量谷蛋白亚基基因。     

尝试利用R-Q对应因子分析识别分群融合子代

在特定融合组合的子代群体中,以不同姊妹菌株作为观察样本(n=N),以蛋白质电泳全部谱带泳动率作为指标(p=P)。则所对应的谱带光密度扫描峰面积作为其观测值(x)(当某菌株缺乏某条带时,其峰面积记为零),利用R-Q对应因子分析程序,解析这个数据矩阵(X_nxp)。能够在同一标度的因子平面上考察这一特定融合重组事件发生后．姊妹菌株间和各菌株内蛋白质谱带位置与含量间以及它们相互之间的多重内在联系,从而推断子代群体与亲本的遗传继承关系。并由此来识别和分群姊妹菌株。这种探索具有拓展数值分类能力和指导融合育种实践的意义．     

金黄色葡萄球菌核酸酶A基因在大肠杆菌中的高效表达

这篇文章报道了金黄色葡萄球菌核酸酶A的克隆和在温控启动子P_RP_L调控下在E．Coli中的高效表达。SDS—PAGE分析表明,核酸酶A的含量可占E．Coli细胞总蛋白含量的60%。经有效的增溶和复性处理后,重组酶具有与天然酶相同的活力;N-末端氨基酸分析的结果指出,fMet在转译后被加工去除;对重组SNaseA在构象上的同一性也通过Phenyl—Su—perose疏水柱层析进行了分析。     

急性T淋巴细胞白血病原癌基因Lmo2的一种全新剪接模式

Lmo2是隶属于LIM蛋白家族的一个T细胞白血病原癌基因,研究显示,它与胚胎卵黄囊期红系发育、成体血细胞分化相关,并且在血管新生过程中发挥着重要的作用.先前的工作显示该基因编码一个158氨基酸的蛋白质,含有2个串联的特征性LIM 结构域,但对于其转录调控方式尚缺乏系统的研究.为进一步了解Lmo2转录水平的表达调控机制,以正常成人肾组织mRNA为材料,结合SMART PCR及5′RACE技术找到了Lmo2基因的一种新的剪接模式.这个新的转录本只含有2个外显子,编码一个151氨基酸的蛋白质.有趣的是,这个蛋白质与LMO2蛋白具有相同的可读框,只是N端7个氨基酸序列不同.将含有转录起始点上游294核苷酸至下游180核苷酸的基因组片段插入报道基因载体并转染COS7细胞系,显示出稳定的启动子活性.对各种不同来源的组织、细胞系进行RT-PCR检测,发现此种剪接模式以不同丰度广泛存在. 关键词     

黄杆菌(Flavobacterium sp.)几丁质酶的纯化和性质

黄杆菌(Flavobacteium sp.)在几丁质的诱导下产生几丁质酶.通过(NH_4)_2SO_4沉淀、DEAE纤维素柱层析、Sephacryl 300柱层析及Sephadex G-75柱层析,从Flavobacterium sp.培养上清液中分离纯化了几丁质酶.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯度分析表明,纯化后的几丁质酶达到了均一的程度.用SDS-PAGE测得该酶的分子量约45D00道尔顿.该酶水解几丁质的最适pH为 7.0,最适温度为50℃,-20C贮存两年以上仍有活性.水解几丁质的Km值为5.0mg/ml.金属离子对几丁质酶活性影响较大,Ca~(2+) 、Co~(2+)’和Cu~(2+)对酶有激活作用.而NH_4~-、Ba~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)对酶有抑制作用.几丁质酶水解几丁质的产物是几丁质二糖.     

镰形扇头蜱两个组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶新基因的克隆与序列分析

蜱是动物常见的外寄生虫,并且传播多种人和动物的疾病,严重危害畜牧业发展和人类健康。为了寻找基因工程疫苗候选抗原基因,根据半胱氨酸蛋白酶的保守性氨基酸序列及镰形扇头蜱氨基酸密码子偏好设计引物,PCR扩增、测序并分析得到2个镰形扇头蜱的半胱氨酸蛋白酶基因片段cysA和cysB,再通过RACE的方法得到全长基因序列。cysA全长168bp,编码332个氨基酸;cysB全长1153bp,编码335个氨基酸。经过分析, CysA和CysB均与其他蜱种或物种的组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶有高度同源性,两者均含有半胱氨酸蛋白酶活性位点处的保守性氨基酸序列, 因此cysA, cysB均为镰形扇头蜱两个新的组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶基因。RT-PCR分析表明,CysA和CysB在镰形扇头蜱的不同发育阶段表达情况不一。     

Smad3基因剔除致骨关节炎小鼠血清蛋白质组双向凝胶电泳分析

Smad3基因剔除导致小鼠骨关节炎。为了进一步深入研究Smad3基因缺失导致骨关节炎形成的分子机制,寻找骨关节炎发生早期的分子变化。用双向电泳技术结合肽质量指纹谱技术对Smad3基因剔除小鼠和野生型小鼠血清蛋白质组进行了初步分析。对其中7个表达差异蛋白质进行了鉴定,并探讨了所鉴定蛋白质与骨关节炎发生的关系。为揭示SMAD3介导的TGF-β信号在骨骼发育中的重要作用提供了线索。      

芒果炭疽病菌β-微管蛋白基因的克隆及其与多菌灵抗药性发生的关系

参照豆科合萌属（Aeschynomene）作物炭疽病菌的tub1和tub2基因序列设计了2对引物,分别从芒果（Mangifera）炭疽病菌对多菌灵(MBC)田间抗药性（MBCR）和敏感（MBCS）的菌株中扩增β_微管蛋白基因。结果只有以tub2为参照设计的引物扩增到了特异片段。进一步对全基因进行了克隆和测序。该基因序列全长1344bp,编码447aa,其核苷酸和氨基酸序列与豆科合萌属炭疽病菌的tub2基因高度同源。对芒果炭疽病菌抗、感菌株β_微管蛋白氨基酸序列进行比较分析,发现第181、237和363位氨基酸发生了突变,而其它位置（如第198位或200位）均不变。     

枯草芽孢杆菌中一个受二硫键还原剂诱导并与伸长因子Tu同源的蛋白质

分析了β-巯基乙醇（β-ME）和二硫苏糖醇（DTT）对枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis细胞蛋白质组分的影响。在LB培养基中,β-ME和DTT处理能诱导一个50kD蛋白质（P50）的合成。在正常生长条件下P50是一个组成性（constitutive）成的细胞质蛋白质。热激也能诱寻P50,但是孢子形成（sporulation）不能诱导P50。在Schaeffer孢子形成培养基中,β-ME和DTT都不能诱导P5O,表明二硫键还原剂诱导P50的能力依赖于特定的生理条件。用VS蛋白酶有限降解P50,得到4个主要的多肽片段,测定了其中两个片段的N-端氨基酸序列。同源性检索发现P50高度同源于蛋白质合成的伸长因子Tu。     

交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DY3菌株产内切葡聚糖酶的性质研究及基因克隆

从深海样品ES0109中分离到一株具有高内切葡聚糖酶活力的细菌DY3, 16ＳrDNA序列分析表明该菌与交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)的Pseudoalteromonas citrea和Pseudoalteromonas elyakovii的同源性为99%。PCR扩增DY3的内切葡聚糖酶基因cel-X全长1479bp,编码一个492AA的蛋白质。酶的氨基酸序列分析表明CelX与Pseudoalteromonas haloplanktis的内切葡聚糖酶CelG有95%的相似性,包括一个糖基水解酶家族5的催化结构域,一个连接序列和位于C端的的CBM5结构域。对酶性质的初步研究发现,CelX的最适温度为40 ℃,酶的最适pH在6～7之间。     

嗜热菌Thermus sp. YBJ-1的分离和淀粉酶基因的克隆

从西藏热泉水样分离得到一株嗜热菌（YBJ-1）,其16S Rdna（1511bp）序列与栖热菌（Thermus scotoductus ITI252T）的同源性为98%。 通过PCR技术将Thermus sp. YBJ-1的淀粉酶基因(amyT)全长开放阅读框克隆到T载体。分析表明, amyT的ORF全长为1767bp,编码588个氨基酸。推导的氨基酸序列与嗜热脂肪芽孢杆菌的阿尔法环糊精酶（Bacillus stearothermophilus alpha cyclodextrinase） 和栖热菌Thermus sp.IM6501的麦芽糖淀粉酶（Thermus sp.IM6501 maltogenic amylase）分别有99%和96%的同源性,与嗜热脂肪芽孢杆菌的新普鲁兰酶（neopullulanas）的同源性为81%。     

三角酵母D-氨基酸氧化酶基因的克隆、测序及表达*

利用跨越内含子的PCR技术,三角酵母(Trigonopsos variabilis)变种FA1-10中扩增得到D-氨基酸氧化酶基因(daao),并通过TA克隆的方法将其克隆至pGEM—T载体。序列测定结果表明,所得daao基因的5’端内含子已被删除,基因总长度为1071bp,它与Trigonopsis variabilis D-氨基酸氧化酶同源性达98.3％,与Fusarium solanii和Rhodotoru-la gracilis的同源性分别是38.9％和30.8％。为提高表达水平,又将此基因转移至高表达载体pET-28b上．在大肠杆菌BL-2l(DE3)中进行诱导表达。经IPTG诱导,目的蛋白的产生量可占菌体总蛋白量的46％,分子量约为38kD。D-氨基酸氧化酶的活力可达802u／L。