鸡大肝大脾病毒RT—PCR检测方法的建立及其检测

鸡大肝大脾病(Big liver and spleen disease,BLS)是发生于商品代肉用产蛋母鸡的一种传染性疾病,1980年最先在澳大利亚发现,1988年Handlinger等对该病进行了描述.感染鸡直到性成熟后才出现临床症状,仅表现为精神沉郁、产蛋下降或达不到产蛋高峰.死亡率为1%.剖检患鸡或死亡鸡见肝脏、脾脏肿大,呈现腹膜炎和肠炎.     

传染性造血器官坏死病病毒高效RT-PCR检测方法的建立

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RT-PCR检测蓝舌病毒技术的建立

蓝舌病毒(Bluetongue Virus,BTV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)的代表种,含10个节段的双链RNA(dsRNA)作基因组.其中,L2节段编码BTV型特异性抗原VP2,L3节段和S7节段编码群特异性抗原多肽VP3和VP7.其中,VP7是BTV粒子的主要结构多肽之一,其编码基因序列保守.VP7具有高度的抗原性,能刺激被感机体产生强的群特异性免疫反应[1].     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和盖他病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

盖他病毒(Getah virus,GETV)可感染猪并引起和猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)相类似的临床表现,且两者可混合感染而难以区分。我国检测PRRSV和其他诸多病毒的多重PCR文献已比比皆是,但尚无同时检测PRRSV和GET V方法的报道。为此,作者根据GenBank中公布的PRRSV和GETV全基因序列,设计了两对分别扩增PRRSV ORF7基因和GETV Cap基因片段的引物,通过反应条件的优化及特异性、灵敏性和重复性试验,首次建立了可同时检测PRRSV和GETV的双重RT-PCR方法。结果显示,该方法可以同时扩增出PRRSV 633 bp和GETV 316 bp的特异性片段,而对猪瘟病毒等其他相关病毒扩增结果均为阴性。对GETV和PRRSV的cDNA最低检测量分别为2.48×10~(-4)ng和2.50×10~(-5)ng。用建立的双重RTPCR方法对河南15个地市92个猪场的136份临床疑似PRRS发病猪样品进行检测,共从58个猪场检出PRRSV单一阳性样品44份,阳性率为32.4%;GETV单一阳性样品7份,阳性率为5.15%;GETV和PRRSV混合感染样品8份,阳性率为5.88%。检测结果与单一RT-PCR结果吻合率达100%。该方法为GETV和PRRSV的快速检测、鉴别诊断和分子流行病学研究等提供了新的技术手段。     

应用RT-PCR检测流产胎儿组织中猪繁殖与呼吸综合征病毒

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型膜蛋白和核衣壳蛋白基因序列,设计了一对含有EcoR I和BamH I酶切位点的引物,用RT-PCR对四个流产猪场的病料进行了检测,扩增出约918 bp的基因片段.通过病毒分离、酶切鉴定和序列分析证实为PRRSV感染.结果说明应用所设计的引物进行RT-PCR快速检测PRRS是可行的,为我国快速特异诊断PRRS和PRRSV强毒株的深入研究奠定了基础.     

小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测方法的建立

为了研制小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测试剂盒,根据GenBank公布的小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒的基因序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于Taqman探针的双重荧光RT-PCR快速检测小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒的方法。实验结果表明,该方法特异性好、灵敏度高,检测最低浓度为10拷贝/μL数量级阳性标准品。通过对临床样品的检测,证实本研究建立的检测方法具有较好的临床应用价值。     

Nipah病毒一步法Real-time RT-PCR检测方法的建立

目的建立针对Nipah病毒N基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于Nipah病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对Nipah病毒的保守基因N设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果所设计的引物经Blast检索可以用于检测所有已知的Nipah病毒株。本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出Nipah病毒,不与Hendra病毒产生交叉反应。检测灵敏度为1.1×100～1.1×101copies/μl。标准曲线的线性范围为1.1×102～1.1×106copies/μl。结论本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于Nipah病毒感染样本的检测。     

北美洲流行汉坦病毒多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立牛轭湖病毒(Bayou virus,BAYV)、纽约病毒(New York virus,NYV)、厄尼诺洛峡谷病毒(El Moro Canyon virus,ELMCV)以及岛景病毒(Isla Vista virus,ISLAV)四种病毒快速筛查、诊断的核酸检测技术,本研究选用上述四种病毒的N蛋白基因作为靶标区域设计四组特异性引物探针,建立四重实时荧光定量RT-PCR检测方法。用四种病毒体外转录RNA进行灵敏度和重复性验证,并使用其他病毒细胞培养物及体外转录RNA进行特异性验证。结果显示,四重实时荧光定量PCR扩增效率均可达到95%以上,四种病毒体外转录RNA灵敏度介于1～10拷贝/μL,与单重检测方法无明显差异,且与其他病毒无交叉反应。稳定性评价结果显示,批内、批间变异系数均在3%以内。本研究所建立的检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于相关样本的诊断与筛查。     

K亚群禽白血病病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank数据库K亚群禽白血病病毒(Subgroup K avian leukosis virus,ALV-K)特异性抗原gp85的基因序列,设计一组ALV-K特异性的引物和探针,并构建阳性重组质粒。在对反应体系进行优化的基础上,建立了ALV-K的实时荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验和重复性试验。结果显示,本方法能对ALV-K进行特异性扩增,而对A亚群、B亚群、J亚群、E亚群禽白血病毒和新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽网状内皮组织增生病病毒(REV)、禽流感病毒(AIV)等禽病病原未见扩增。该方法最低能够检测到3.4×10~1拷贝数/μL的阳性质粒,灵敏度是RT-PCR的100倍。应用本方法对人工攻毒ALV-K的SPF鸡各脏器进行病毒定量分析,结果显示,在攻毒鸡体内心、肝、脾、肺、肾等脏器中均能检测到ALV-K,且肝、肾和脾中的病毒含量显著高于心和肺(P0.01)。     

蜜蜂克什米尔病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立和评价

蜜蜂克什米尔病毒(Kashmir bee virus,KBV)是一种高毒力的急性蜜蜂病毒,可以引起蜜蜂的死亡和蜂群崩溃.本研究旨在建立一种灵敏、快速检测KBV的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法.参照GenBank中polymerase polyprotein有关基因序列,设计一组特异性引物和探针,并通过体外转录法制备RNA标准品作为阳性模板.在对反应体系进行优化的基础上,建立了 KBV的实时荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样本验证.结果显示:该方法能有效扩增8×100拷贝/μL～8×107拷贝/μL 的KBV标准品,建立的标准曲线呈现良好的线性关系.该方法的检测灵敏度为8拷贝/μL,对其他蜜蜂病毒不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示组内和组间的变异系数分别低于1％和2％,重复性良好.应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法的特异性优于常规RT-PCR.本研究建立的实时荧光RT-PCR检测具有良好的敏感性、特异性和重复性,为KBV的检测和流行病学调查提供技术支持.     

猴D型反转录病毒巢式PCR检测方法的建立

目的建立SRV-1巢式PCR检测方法并进行初步应用。方法针对SRV-1env基因的保守区序列,设计特异性引物,以感染SRV-1 Raji细胞提取出的含有前病毒DNA的基因组DNA为模板,进行巢式PCR反应。扩增产物测序后与GenBank报道的序列进行同源比对。将DNA样本进行10倍梯度稀释,以检测巢式PCR反应的灵敏度。使用该方法对正常Raji细胞以及感染SIV、STLV的外周血淋巴细胞DNA样本进行扩增,检测该方法的特异性。用建立的巢式PCR方法检测40份储存猴血标本。结果使用巢式PCR扩增出的特异片段经测序分析,结果证实与GenBank报道的序列一致。所建立的巢式PCR检测法检测限度可达1.5×10-3ng/μL,而且方法特异。用此方法检测40份猴血标本,未检测到阳性标本。结论初步建立SRV-1的巢式PCR检测方法,该方法灵敏、特异,为SRV-1的检测提供了一个快速、有效的手段。     

HCVRNA反转录PCR技术的建立及对血液样品的检测

实验建立了ＨＣＶ　ＲＮＡ的反转录和套式ＰＣＲ技术,扩增出２３２ｂｐ的核酸片段,经酶切电泳图谱和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定,来自ＨＣＶ基因５,端非编码区。实验从抗ＨＣＶ阳性的１８例血浆样品和１９例血清样品中分别检出７例和１３例ＨＣＶＲＮＡ阳性。     

RT—PCR检测蓝舌病毒技术的建立

蓝舌病毒 (ＢｌｕｅｔｏｎｇｕｅＶｉｒｕｓ,ＢＴＶ)是呼肠孤病毒科 (Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ)环状病毒属 (Ｏｒｂｉｖｉｒｕｓ)的代表种 ,含10个节段的双链ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)作基因组。其中 ,Ｌ2节段编码ＢＴＶ型特异性抗原ＶＰ2 ,Ｌ3节段和Ｓ7节段编码群特异性抗原多肽ＶＰ3和ＶＰ7。其中 ,ＶＰ7是ＢＴＶ粒子的主要结构多肽之一 ,其编码基因序列保守。ＶＰ7具有高度的抗原性 ,能刺激被感机体产生强的群特异性免疫反应[1] 。蓝舌病毒的易感宿主是牛、羊及野生反刍动物 ,死亡率高达 6 0 %～ 70 %以上 ,并且至今仍无有效的防治措施 ,对畜牧业…     

应用RT-PCR制备登革病毒诊断基因芯片探针

根据GenBank数据库中的生物信息,利用BLAST免费分析软件找出4种型别登革病毒的保守序列及各型特异性序列,针对上述序列设计引物经RT-PCR扩增登革病毒的特异片段,利用此RT-PCR法收集探针是一种快速、简便制备基因芯片探针的实用方法。     

犬瘟热病毒（CDV）ELISA检测方法的建立与应用

目的建立犬CDV抗体ELISA检测方法。方法培养vero细胞,接种CDV病毒,制备vero正常抗原和CDV特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行精密性、敏感性、稳定性、特异性实验。结果正常、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为1∶32 000、10μg/mL和1∶8 000;正常、特异抗原批内变异系数分别为9.1%和5.8%,批间平均变异系数分别为8.8%和6.6%;检测灵敏度为1∶2 560;与犬细小病毒（CPV）、犬肝炎病毒（ICHV）均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。可用于犬CDV抗体的检测。     

禽流感和新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的：建立二重荧光定量RT-PCR方法,用于禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒（NDV）的检测。方法：根据AIV和NDV的基因保守序列,设计了AIV和NDV的2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针;对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测AIV和NDV的Z-重荧光定量RT-PCR方法。结果：所建方法特异性好,对AIV和NDV的检测敏感性均达到2000个模板拷贝数,比常规RT-PCR敏感性高100倍;抗干扰能力强,对AIV和NDV不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测2种病毒。对保存的AIV或NDV鸡胚尿囊液及临床病料进行二重荧光定量RT-PCR检测,结果尿囊液检测的拷贝数均达到10^10/μL以上,临床病料的拷贝数为2．13x10^8-6．52x10^4／μL。结论：建立了用于检测AIV和NDV的二重荧光定量RT-PCR法,该方法特异、敏感、快速、可定量,对AIV和NDV的防制有重要意义。     

Detection of Sclerotinia sclerotiorum in Planta by a Real-time PCR Assay

Stem rot caused by Sclerotinia sclerotiorum is a very serious disease on oilseed rape worldwide. In this study, a pair of polymerase chain reaction (PCR) primers was designed based on the nucleotide sequence of a DNA region amplified by a microsatellite primer M13. The primer pair amplified a 252-bp fragment from all S. sclerotiorum isolates collected from oilseed rapes at different locations in different years, but not from any other fungus tested. Using this pair of primers, a real-time PCR assay was developed to rapidly detect early infection of S. sclerotiorum on petals of oilseed rape. The real-time PCR assay developed in this study could help growers make a timely decision on fungicide application.