三角帆蚌金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RACE技术,获得了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)金属硫蛋白基因的全长cDNA序列.该序列全长467 bp,由长92 bp的5'UTR(untranslated region),159 bp的3'UTR,和216 bp的开放阅读框(openreading frame,ORF)组成.共编码71个氨基酸,分子量大约为7.1 ku,理论等电点为7.24.该蛋白序列中半胱氨酸含量最丰富(29.6%),其次是甘氨酸(14.1%),存在软体动物金属硫蛋白的特征序列CKCXXXCXCX,且C-末端的氨基酸序列也符合软体动物金属硫蛋白标签序列C-X-C-X(3)-C-T-G-X(3)-C-X-C-X(3)-C-X-C-K.蛋白序列特征分析表明,该序列与其他贝类的金属硫蛋白基因具有很高的相似性,具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族的成员.     

微波辅助提取灰树花多糖工艺研究

采用提取时间、微波功率、液料比的单因素试验和正交试验法优化微波辅助提取灰树花多糖条件.结果表明,以净多糖得率为指标,影响微波辅助提取灰树花多糖的主次因素为:提取时间＞微波功率＞液料比,并且提取时间和微波功率的影响达到了极显著水平.灰树花多糖最佳提取工艺条件为:提取时间为10 min,微波功率为80%(全功率为800 W),液料比为25∶1.创立了一种用苯酚-硫酸法测定多糖时排除蛋白质干扰的方法.     

三角帆蚌精子的形态及超微结构

运用电子显微镜技术对三角帆蚌精子的形态和超微结构进行研究。结果发现,三角帆蚌精子为原生型,分为头部、中段和尾部,头部呈子弹头形,电子致密且均匀,主要是核所在的区域。核前端由3－4个小的电子致密颗粒组成一个浅弧形的囊泡,为顶体结构,中段具有5个球形线粒体,环绕着两个相互垂直的中心粒。中段末端具有的鞭毛质领结构（flagellar collar)为一电子致密环,与远端中心粒之间由9个分叉的电子致密小片连接。尾部为典型的9＋2结构。     

三角帆蚌精子的发生

报道了光镜和透射电镜下三角帆蚌精子的发生过程及其一系列重要的形态变化。包括核延长,染色质浓缩,线粒体逐渐融合并后移;胞质减少及鞭毛形成,精原细胞是精巢中体积最大的细胞,细胞膜界限不明显,内质网发达,精母细胞开始出现中心粒,精细胞分化可分为3个阶段。成熟精子属原生型,由头部、中段和尾部三部分组成。     

三角帆蚌短型肽聚糖识别蛋白S3基因克隆及表达分析

肽聚糖识别蛋白（PGRPs）是机体先天免疫系统中的重要模式识别受体,研究对三角帆蚌的一种短型肽聚糖识别蛋白进行了克隆与表达分析。研究采用5、3 RACE技术,对高通量转录组测序所得三角帆蚌PGRPS3基因（hcPGRPS3）片段分别进行了5,3末端克隆,经拼接得到hcPGRPS3 cDNA全长序列。采用多种分子生物学软件对hcPGRPS3 cDNA全长序列进行了特征分析,实时荧光定量（qRT-PCR）检测了其组织分布,及经肽聚糖（Peptidoglycan,PGN）和脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激后其在肝胰腺中的基因表达变化。hcPGRPS3 cDNA全长1438 bp,开放阅读框为858 bp,编码285个氨基酸,预测分子量大小为32.3 ku,pH 7.0时的理论等点为7.98。序列中不存在信号肽与跨膜结构。氨基酸序列保守性分析表明,其他物种短型PGRP中,以夏威夷短尾鱿PGRP4与hcPGRPS3同源性最高（51%）。qRT-PCR检测结果显示,hcPGRPS3在性腺及肝胰腺中表达水平较高。经PGN或LPS刺激后,肝胰腺中hcPGRPS3表达水平显著上调,表明hcPGRPS3可能在机体抗菌免疫反应中发挥重要作用。     

贵州野生甜藤多糖的提取与脱蛋白方法研究

以贵州野生甜藤干粉为原料,通过单因素试验,再通过正交试验优化甜藤多糖提取工艺,并采用Sevag法、TCA法、Sevag-TCA法、HCl O4法进行脱蛋白方法研究。结果表明,甜藤多糖最优提取工艺为:以水为溶剂,料液比1∶50,超声功率70 W,水浴温度70℃,超声提取时间110 min,提取2次;HCl O4法脱蛋白效果最佳,经3次脱蛋白处理后蛋白脱出率为94.78%,多糖损失率为15.14%,该法用于脱除甜藤植物多糖中的蛋白质,工艺简单,成本低,具有一定应用价值。     

三角帆蚌热休克蛋白60基因克隆及其表达分析

利用3'RACE技术, 对高通量转录组测序所得三角帆蚌HSP60基因（hcHSP60）长片段（2629 bp）进行了3'末端克隆, 经拼接得到hcHSP60 cDNA全长序列。采用多种分子生物学软件对hcHSP60 cDNA全长序列进行了特征分析, 并采用RT-PCR技术检测了其组织分布及经冷热应激后的表达变化。结果显示, hcHSP60 cDNA全长为2807 bp, 其中开放阅读框为1707 bp, 编码568个氨基酸, 预测分子量大小为61.04 ku, pH 7.0时的理论等电点为5.63。序列中不存在信号肽与跨膜结构。氨基酸序列保守性分析表明, hcHSP60氨基酸序列与光滑双脐螺HSP60同源性最高（达82%）, 而与牙鲆、白云金丝鱼HSP60的同源性最低（为75%）。RT-PCR检测结果表明, hcHSP60在肝胰腺中的表达水平最高, 而在血液中的表达水平最低。30℃与35℃水温处理三角帆蚌4h后, 各组织中hcHSP60表达水平明显上升, 表明hcHSP60可能在三角帆蚌耐热应激反应中起着重要作用。       

微波法提取楮实子多糖的工艺研究

采用单因素试验和正交试验,对微波法提取楮实子多糖的工艺进行研究,得到了最佳工艺条件:料液比1∶15,微波处理时间12 min,微波功率450 w,浸泡时间180min.在此条件下,楮实子多糖的提取率为8.79％.     

微波提取天仙果多糖的工艺研究

本文通过对影响天仙果多糖提取的因素进行工艺研究 ,初步确认微波提取天仙果多糖宜在 80℃的碱性介质中结合微波前处理可获较高提取率。通过大孔树脂纯化 ,以及纸层析和硅胶G薄板层析分析表明 ,碱性介质中微波提取的天仙果多糖是复合多糖 ,可能由三个均一多糖组分组成。     

三角帆蚌珍珠有机质的红外光谱分析

本文采用生物化学研究方法,采用弱酸去钙法成功除去无机成分碳酸钙,并保留完整的有机大分子,运用红外吸收光谱（IR）对其进行分析检测,结果显示：珍珠有机质具有特定的IR图谱,且珍珠有机质可分为可溶有机质和不可溶有机质,可溶有机质在3298cm^-1,1658cm^-1,1547cm^-1,1534cm^-1等处有特征吸收峰,表明可溶有机质主要是蛋白质和色素分子形成的复合物,不可溶有机质在3281cm^-1,1655cm^-1,1524cm^-1等处有较强吸收峰,表明不可溶有机质主要是壳角蛋白。     

三角帆蚌GPX基因cDNA全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析

根据本实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列, 利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPX)基因cDNA全序列。序列分析表明, 该基因cDNA序列全长1286 bp, 包括5′端非翻译区(Untranslated Region) 39 bp、3′端非翻译区659 bp和开放阅读框(Open reading frame, ORF)588bp, 共编码195个氨基酸, 分子量约为22.2 kDa, 理论等电点为8.44, 属于含硒类GPX。该氨基酸序列具有GPX所有亚型中均高度保守的3个环状结构, 对酶的三级结构起稳定作用。在线分析结果表明: GPX的氨基酸序列不存在明显的疏水区, 也不存在信号肽序列。氨基酸相似性对比结果显示, 三角帆蚌GPX氨基酸序列与脊椎动物GPX-2及GPX-1的序列相似度较高, 为73.1%-80.8%, 与其他型GPX相似度较小, 相似度低于60%。构建的系统进化树显示三角帆蚌GPX与其他几种鱼类GPX聚为一类, 与其他已发表的几种软体动物GPX相距较远, 推测本实验克隆的三角帆蚌GPX基因和已发表的软体动物不属于同一种GPX类型。     

瘟病病毒感染对三角帆蚌主要消化器官的影响

通过人工感染实验,在感染三角帆蚌瘟病病料组织后第3、5、7、9、11 d,运用光学显微镜和电子显微镜分别观察了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)主要消化器官的病理变化特征.结果表明,三角帆蚌瘟病病毒(H.cumingii Plague Virus,HcPV)严重破坏了三角帆蚌消化器官的结构.主要消化腺肝损伤最为严重:光镜下,攻毒7 d内腺管肿大,管腔缩小,7 d后腺管细胞空泡化并形成多核体;电镜下,线粒体、内质网等细胞器结构破坏,病毒粒子增殖速度快.消化道的病理变化主要表现为胃、肠结构的破坏,胃肠基本结构及感染病毒后的病理变化相似:光镜下,攻毒7 d内胃肠结构变化不大,7 d后柱状细胞肿大,纤毛脱落,并伴有上皮细胞的脱落;电镜下,细胞器结构破坏,甚至空泡化,病毒粒子前期增殖较慢,后期增殖较快,但总体增殖速度比肝慢.     

香菇多糖微波辅助提取及体外免疫学活性研究

利用微波辅助水浸提法优化影响香菇多糖提取的单因子试验(料液比、浸提温度、浸提时间、微波处理时间等)和多因子的正交试验[L9(34)]。结果表明,香菇多糖的最佳提取条件为:料液比1∶30,浸提温度90℃,浸提时间2h,微波处理3m in。在此条件下,香菇多糖提取率为4.75%。香菇多糖粗品的体外免疫学研究的结果表明,在25~1600μg/mL的浓度范围内,多糖都具有促进小鼠脾淋巴细胞体外增殖的作用;在25~400μg/mL的浓度范围内,多糖对脾淋巴细胞增殖活性呈现一定的剂量依赖性。     

三角帆蚌热休克蛋白70基因克隆及其表达分析

对三角帆蚌HSP70基因序列进行全长克隆及其分子生物学分析,并检测其在不同水温刺激下鳃组织中的表达变化。通过高通量转录组测序获得三角帆蚌HSP70基因（HcHSP70）长片段,采用3'RACE对其进行了3'末端克隆,经拼接得到HcHSP70 cDNA全长序列。采用多种分子生物学软件对HcHSP70 cDNA全长序列进行了特征分析,采用实时荧光定量PCR技术检测了其组织分布,并结合Western-blot技术检测蚌鳃中该基因mRNA与蛋白经不同水温刺激后的表达变化。结果显示,HcHSP70 cDNA全长为2298 bp,其中开放阅读框为1974 bp,编码657个氨基酸。预测分子量大小为71.6 Ku,pH7.0时的理论等电点为5.61。氨基酸序列分析表明,HcHSP70氨基酸序列含HSP70家族的3个标签序列（I₉DLGTTYS₁₆、I₁₉₇FDLGGGTFDVSIL₂₁₀和I₃₃₆ VLVGGSTRIPKVQK₃₅₀）,与长牡蛎及泥蚶的HSP70同源性最高（91%）。实时荧光定量PCR检测结果显示,HcHSP70在鳃、性腺、肝胰腺、外套膜及肌肉等5种被检组织中均有表达,以肝胰腺中的表达水平最高。实时荧光定量PCR与Western-blot技术检测皆表明,蚌鳃组织中HcHSP70基因与蛋白的表达量在37℃时达到最高,而在40℃水温刺激下表达水平下调至正常值,表明其在适应高温刺激时发挥了重要作用。     

池蝶蚌和三角帆蚌谷胱甘肽S转移酶基因表达特征

采用RT-PCR方法克隆获得池蝶蚌(Hyriopsis schlegerlii)和三角帆蚌(H.cumingii)GST片段,两种蚌的GST核苷酸序列相同,推导其编码92个氨基酸;经与不同物种进行氨基酸序列比对,显示其与软体动物、两栖动物和高等哺乳动物的GST具有高度同源性。RT-PCR半定量分析表明,GST在两种蚌的肝、闭壳肌等11种组织中除肠以外均有表达,肝中表达量较大;注射嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后,三角帆蚌血细胞中GST表达量先降低后升高,而池蝶蚌血细胞中GST表达量先升高后降低,且在感染3h、6h、9h和24h时表达量约为三角帆蚌的2倍。     

利用三角帆蚌控制水华的初步研究

富营养化已成为全球面临的主要环境问题之一。目前,治理水体富营养化,主要从两方面来进行:一是控制外源性营养物质输入,如截污分流和污水集中处理,主要用于控制点源污染;二是减少内源性营养物质负荷,如微生物修复、底泥疏浚、化学法、人工湿地、水生植被恢复等,其目的是控制面源污染和加快湖泊的恢复速度[1—5]。上述研究方法单一或联合采用,已在一些湖泊取得一定的效果。本文以汉阳莲花湖为例,在实验室多次模拟试验的基础上,在富营养化水体中引入三角帆蚌,研究利用三角帆蚌控制浮游植物的过量生长。1材料与方法莲花湖已经严重富营养化,水质…     

三角帆蚌食性及摄食率的初步研究

三角帆蚌( Hyriopsis cumingii) 属滤食性双壳贝类, 通过滤水来摄食水中的浮游生物和有机碎屑等食物, 可使水质得到相应改善。作者在水库已连续多年开展了较大规模的三角帆蚌净水试验研究工作。       

仙人掌多糖提取过程中脱蛋白方法的研究

用水提取的仙人掌多糖常含有蛋白质C,实验以多糖损失率和脱蛋白率为衡量指标,选用了Sevag法、三氯乙酸法和酶法对仙人掌多糖提取物进行脱蛋白处理。实验结果表明,酶法、三氯乙酸法和Sevag法的脱蛋白率分别为89.67%、56.20%和45.65%,多糖损失率分别为7.19%、9.49%和13.75%。因此,酶提取法是替代常规方法的一种有效方法。     

三角帆蚌幼蚌贝壳形态及体重生长规律

为了掌握三角帆蚌幼蚌贝壳形态及体重的生长规律,采用模型拟合的方法研究了三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）幼蚌一个生长周期内4个贝壳性状形态及体重性状的生长规律。结果显示,三角帆蚌幼蚌的贝壳形态与体重的增长过程均遵循Logistic生长模型。运用Levenberg-Marquardt迭代法估计出生长模型中的3个生长参数,得到在观测周期内各性状的生长极限值分别为,壳长9.216 cm、壳高4.985 cm、壳宽2.212 cm、全高8.262 cm、体重75.240 g;各性状的快速生长区间分别为壳长2.211 ~ 5.181月龄、壳高2.107 ~ 5.363月龄、壳宽2.712 ~ 5.470月龄、全高2.294 ~ 5.026月龄、体重4.247 ~ 8.065月龄,可见体重具有明显的生长延缓现象。各性状的瞬时增长率曲线均呈钟型,先增大到达生长拐点后又逐渐减小;瞬时增长加速度曲线为倒S型曲线,有最高和最低点;相对增长率在养殖初期最大,然后随着生长逐渐下降。上述结果可为三角帆蚌的养殖生态及选择育种提供参考。     

采用微波技术提取桑叶多糖的工艺研究

本试验以干燥桑叶粉为材料,在单因素实验的基础上,采用Box-Benhnken中心组合实验和响应面分析法,研究了提取时间、微波功率和料液比对桑叶多糖提取率的影响,确定了微波提取桑叶多糖的最佳工艺条件;与热水浸提法相比,微波法提取率高,且所得桑叶多糖更能明显提高四氧嘧啶糖尿病小鼠的糖耐量,是一种更好的桑叶多糖提取方法。