Macro Domain家族成员LRP16是多种核受体的相互作用因子

LRP16基因是macro domain家族成员之一,C末端含有唯一的1个保守的功能结构域. 既往研究表明,该基因具有雌激素反应性,并可通过与雌激素受体α （ERα）相互作用调控其转录活性.近期我研究组发现,LRP16可与雄激素受体（AR）的共激活因子ART-27相互作用.本研究首先通过GST pull-down方法验证LRP16/ART-27/AR三者之间相互作用关系,并用免疫共沉淀实验明确了LRP16与AR存在直接的相互作用,且这种相互作用并不依赖于ART-27的存在;采用GST pull-down进一步明确LRP16与AR相互作用的结构域.结果发现,LRP16通过C端的macro domain结构域与AR的LBD域相互作用;鉴于核受体家族有较高程度的氨基酸序列保守性与功能结构域的相似性,通过GST pull-down验证了LRP16与核受体超家族成员ERβ、GR、PPARα、PPARγ的相互作用,提示LRP16至少还可与ERα以外的5个核受体家族成员相互作用;进一步采用核受体荧光素酶报告基因转染细胞,通过检测荧光素酶活性证实LRP16可增强AR、GR、ERβ、PPARα、PPARγ的转录激活活性.本研究初步证实,macro domain家族成员LRP16可与多个核受体相互作用,并增强其转录激活活性,是核受体家族的共激活因子,为进一步研究LRP16在核受体转录调控中的生理病理学功能奠定基础.     

利用酵母双杂交技术筛选人PROKR2蛋白C端相互作用蛋白

目的:利用酵母双杂交技术从人c DNA文库中筛选人前动力蛋白受体2(hPROKR2)C端相互作用蛋白。方法:复苏酵母菌Y2HGold-hPROKR2-C,与人c DNA文库杂交,计算杂交效率;筛选相互作用克隆并测序,寻找hPROKR2蛋白C端相互作用蛋白;通过在DDO/X、QDO/A/X平皿上划线,对筛选到的人c DNA文库质粒的自活性进行验证;采用GST pull down进一步验证两者之间的相互作用。结果:酵母双杂交实验的杂交融合效率为1.375×10~8;在人cDNA文库中筛选出hPROKR2蛋白C端相互作用蛋白SNAPIN,GST pull down实验证实两者之间存在相互作用。结论:SNAPIN可与hPROKR2蛋白C端结合。     

脆性组氨酸三联体与复制蛋白A相互作用的鉴定

目的：研究脆性组氨酸三联体（Fhit）对ATR／CHKl通路的影响,确定Fhit与复制蛋白A（RPA）存在相互作用,为进一步研究Fhit特异的信号通路奠定基础。方法：将Fhit全长基因插入含GST基因的原核表达载体中,在大肠杆菌中表达纯化GST-Fhit融合蛋白,并用GST沉降技术研究Fhit与RPA是否在体外存在相互作用;在表达Fhit的人细胞中用免疫共沉淀技术分析Fhit与RPA是否在体内存在相互作用,同时用免疫荧光染色方法研究Fhit与RPA在细胞内是否可以共定位。结果：通过免疫共沉淀、免疫荧光染色及GST沉降技术,确定了Fhit与RPA在体内及体外均可以相互作用。结论：确定了Fhit与RPA之间存在相互作用,为阐明Fhit在维持基因组完整性方面的机理提供了线索。     

GST-pulldown体外研究LRP16与NF-κB/p65相互作用的功能表位

目的:构建核转录因子NF-κB/p65亚基的功能表位载体,采用GST-pulldown探究p65与LRP16体外相互作用的功能表位。方法:以真核表达质粒pcDNA3.1-p65为模板,PCR扩增一组p65功能表位的基因片段,经测序后,克隆至pcDNA3-flag载体上,用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切重组质粒鉴定目的片段大小,然后采用GST-pulldown实验验证LRP16与p65之间的相互作用。结果:构建了p65的5个功能表位的表达载体且可用于体外转录翻译,GST-pulldown体外研究表明,p65蛋白N端RHD结构域是与LRP16相互作用所必需的,p65的RHD结构域的缺失完全消除了p65与LRP16的体外相互作用。结论:GST-pulldown实验验证了LRP16与p65存在体外直接相互作用,并具体分析了LRP16与p65相互作用的表位。     

GST-pulldown体外研究LRP16与NF-KB/p65相互作用的功能表位

目的:构建核转录因子NF-κB/p65亚基的功能表位载体,采用GST-pulldown探究p65与LRP16体外相互作用的功能表位.方法:以真核表达质粒pcDNA3.1-p65为模板,PCR扩增一组p65功能表位的基因片段,经测序后,克隆至pcDNA3-flag载体上,用BamH Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切重组质粒鉴定目的片段大小,然后采用GST-pulldown实验验证LRP16与p65之间的相互作用.结果:构建了p65的5个功能表位的表达载体且可用于体外转录翻译,GST-pulldown体外研究表明,p65蛋白N端RHD结构域是与LRP16相互作用所必需的,p65的RHD结构域的缺失完全消除了p65与LRP16的体外相互作用.结论:GST-pulldown实验验证了LRP16与p65存在体外直接相互作用,并具体分析了LRP16与p65相互作用的表位.     

人PIRH2b与ARF4相互作用的初步研究

目的 利用酵母双杂交技术筛选PIRH2b的相互作用蛋白。方法 以PIRH2b为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术筛选人胎肝cDNA文库,用GST—pull down验证PIRH2b与ARF4在体外的相互作用,并用绿色荧光蛋白标记PIRH2b,红色荧光蛋白标记ARF4,观察两者在肝癌细胞株Hep3B中的亚细胞定位。结果利用酵母双杂交筛选到一个能与PIRH2b相互作用的蛋白ARF4,GST—pull down验证了两者在体外的相互作用,荧光标记共定位结果显示两个蛋白共定位于Hep3B细胞的核周区域。结论首次发现并证实了PIRH2b与ARF4的相互作用,PIRH2b对ARF4的功能可能有重要影响。     

SARS冠状病毒N蛋白和CYP4F3的相互作用

目的：研究SARS冠状病毒（SARS-CoV）N蛋白与CYP4F3的相互作用。方法：应用免疫共沉淀、GST—pull down、BIACORE实验验证SARS—CoVN蛋白与CYP4F3的相互作用。结果：SARS—CoVN蛋白与CYP4F3能够相互作用,BIA-CORE实验证实CYP4F3与SARS—CoVN蛋白的亲和常数为Ko=4．3×10^-11。结论：SARS—CoVN蛋白与CYP4F3在细胞内、外均能形成复合物,这为进一步探讨SARS—CoVN蛋白在SARS致病机理中的作用奠定了基础。     

EBNA3C与Gemin3两种蛋白形成复合物及相互作用的结构域

探讨EB病毒核抗原3C(EBNA3C)与Gemin3的相互结合及其作用区域。用Flag-EBAN3C与GFPGemin3共转染HEK 293细胞,采用免疫共沉淀、谷胱苷肽-S转移酶共沉淀及免疫荧光蛋白共存实验确定EBNA3C与Gemin3两种蛋白在体内、体外相互结合及相互作用的结构域。EBNA3C与Gemin3两种蛋白在体内外相结合,二者通过各自的C端相互结合。EBNA3C与Gemin3两种蛋白形成稳定复合物。     

IRSp53和MIM同源结构域IMD相互作用蛋白质的鉴定

IRSp53(胰岛素受体酪氨酸激酶底物)和MIM(肿瘤转移消失蛋白)的同源结构域(IMD结构域)在IR-Sp53/MIM家族调控肌动蛋白动态变化的过程中起重要作用.IMD结构域具有使肌动蛋白纤维成束的活性,与小分子GTPase家族Racl也存在相互作用.然而,IMD结构域是否存在其它相互作用蛋白并不清楚.本研究利用GST pull down技术结合质谱分析从大鼠小脑中筛选IMD结构域的相互作用蛋白,得到了几个候选蛋白.其中,神经发育中下调蛋白NEDD9与IRSp53及MIM在小脑中存在类似的分布,体外实验进一步证明了两者之间的相互作用,暗示NEDD9是一种新的IMD结构域相互作用蛋白质.     

α-Synuclein与14-3-3蛋白在体外分子间相互作用的鉴定

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)涉及两种蛋白——α-synuclein蛋白(SNCP)与14-3-3蛋白.通过重组,将这两种蛋白在大肠杆菌DH5α中表达, 通过谷胱甘肽- Sepharose 4B亲和层析将其纯化,得到GST-14-3-3蛋白;利用凝血酶对纯化的融合蛋白GST-SNCP切割,再经谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析获得SNCP.通过免疫共沉淀、GST pull down和ELISA等技术,证明SNCP能够与14-3-3蛋白结合;为了进一步证明SNCP也与在脑组织中的天然14-3-3蛋白发生作用,利用His pull down方法进行实验.结果证明,SNCP能够和脑组织中的14-3-3蛋白发生相互作用.这些结果从分子水平提供了SNCP与14-3-3蛋白相互作用的实验证据,为进一步了解SNCP的结构和功能,及其在中枢神经系统退行性疾病的作用提供了必要的实验基础.     

SOX11结合p53并上调其转录活性

目的:研究SOX11对p53转录活性的影响,并检测二者的体外相互作用。方法:在H1299(p53缺失)和H460(含野生型p53)2种细胞中分别过表达SOX11和p53,用双萤光素酶方法测定p53的转录活性;用大肠杆菌DH5α表达GST和GST-p53融合蛋白并将其纯化,用GST pull-down实验检测SOX11与p53在体外是否存在相互作用。结果:萤光素酶实验结果表明,在H1299和H460细胞中,过表达SOX11分别能促进外源p53和内源p53的转录活性;GST pull-down实验表明SOX11能在体外与p53发生相互作用。结论:SOX11能在体外与p53发生相互作用并促进p53的转录活性,为进一步研究p53的功能提供了新的线索。     

LRP16短发夹RNA慢病毒载体的构建及LRP16稳定抑制细胞的建立简

目的：构建靶向LRPl6基因的短发夹RNA（shRNA）慢病毒表达载体,鉴定其在HeLa细胞中对LRP16的抑制效果。方法：构建pWPT-U6-LRPl6shRNA-CMV-GFP慢病毒载体,通过病毒感染、细胞筛选、Western印迹等步骤,获得LRP16基因稳定抑制的细胞株。结果：构建了具有LRP16干扰效果的慢病毒载体,感染HeLa细胞后获得了稳定沉默LRP16及对照的细胞株;经克隆筛选,在荧光显微镜下观察到近似100％感染细胞发出绿色荧光;Western印迹证实pWPT-U6-L374-CMV-GFP和pWPT-U6-L668-CMV-GFP均可显著抑制HeLa细胞株中LRP16蛋白的表达,其中pWPT-Gsi-L374-GFP的抑制效果更好。结论：构建了靶向人LRP16基因shRNA慢病毒载体及LRP16稳定抑制的HeLa细胞系。     

B型肉毒毒素受体结合区C片段在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究

目的:在大肠杆菌中表达、纯化B型肉毒毒素受体结合区C片段(BHc-C),研究其免疫原性。方法:将BHc-C基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达GST-BHc-C融合蛋白并通过亲和纯化;以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备免疫血清,采用ELISA检测免疫血清的效价并测定其抗B型肉毒毒素中和活性。结果:在大肠杆菌中表达了GST-BHc-C融合蛋白;以该融合蛋白免疫小鼠获得高效价免疫血清,且该免疫血清具有中和活性。结论:获得了GST-BHc-C融合蛋白,并证实其具有免疫原性。     

CUEDC2与雌激素受体β相互作用并抑制其转录活性

目的：探索未知功能蛋白CUEDC2对雌激素受体（ER）β转录活性的调控,为进一步阐明CUEDC2在乳腺癌发生发展中的作用提供线索。方法：运用双荧光报告系统检测雌激素受体的转录激活活性,运用GST pull-down技术检测CUEDC2与ERβ的相互作用,同时外源过表达CUEDC2及ERβ,通过Western印迹检测CUEDC2对ERβ表达水平的影响。结果与结论：CUEDC2能够与ERβ相互作用并抑制ERβ的转录活性,但其对ERβ的表达水平没有影响。     

猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原AN端保护区在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A（SpaA）N端保护区（SpaA-N）,并检测其抗原性。方法：利用PCR方法从猪丹毒丝菌C43065株基因组中扩增出spaA基因片段,构建pMD18-spaA重组质粒并对插入片段进行测序;以pMD18-spaA重组质粒为模板,PCR扩增得到spaA-N基因片段,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）,再经IPTG诱导表达GST-SpaA-N融合蛋白并纯化。结果：扩增得到的spaA基因长1881bp,编码由626个氨基酸残基构成的多肽;SDS-PAGE和Western印迹检测结果表明,诱导表达获得相对分子质量约64000的GST-SpaA-N融合蛋白,该融合蛋白能与相应抗体发生特异性反应。结论：获得了在大肠杆菌中可溶性表达的GST-SpaA-N融合蛋白,为进一步研究猪丹毒丝菌免疫保护性抗原奠定了基础。     

SOX4能与p53蛋白发生相互作用

目的：研究SOX4和p53蛋白之间的相互作用。方法：应用GSTpull-down、免疫共沉淀实验验证相互作用。结果：GSTpulldown实验证实SOX4能结合GST-p53融合蛋白,但不能结合GST蛋白;免疫共沉淀实验也证明,SOX4与p53能在细胞内发生相互作用。结论：SOX4能与p53发生相互作用,为p53信号通路的研究提供了新的线索。     

利用酵母双杂交技术筛选与hPOT1相互作用的新蛋白

目的:利用酵母双杂交系统筛选与人POT1(human protection of telomeres 1,hPOT1)相互作用的蛋白。方法:以hPOT1的300～634氨基酸片段为诱饵,在人乳腺cDNA文库中筛选能与hPOT1相互作用的蛋白质;运用营养缺陷型培养基和X-α-Gal实验排除假阳性,并对阳性克隆进行序列测定和比对。结果:经过酵母双杂交筛选,发现7个与hPOT1相互作用的蛋白;选取NM23B与hPOT1通过GST-pull down和免疫共沉淀进行进一步的验证,结果证明它们确实存在相互作用。结论:hPOT1能与NM23B发生相互作用,在此实验基础上可以进一步研究NM23B与hPOT1相互作用的生物学意义。     

人巨细胞病毒UL55编码蛋白结合蛋白的筛选与鉴定

从人胎脑c DNA文库中筛选和鉴定出与人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)UL55编码蛋白结合的蛋白。将UL55基因编码区克隆到诱饵载体p GBKT7中,在证实UL55蛋白不具有自激活作用的前提下,采用Match-maker GAL酵母双杂交系统筛选人胎脑c DNA文库中与UL55蛋白结合的宿主蛋白,用酵母双杂交回转实验验证UL55蛋白与获得的蛋白结合的可靠性。将酵母双杂交筛选出的文库蛋白烯醇化酶1(enolase1,ENO 1)构建到p GEX-4T-2载体上,利用GST pull-down技术体外验证ENO 1与HCMV UL55蛋白的结合。并依据所筛选出蛋白的生物学功能分析UL55蛋白可能的生物学功能。结果显示有10种蛋白与HCMV UL55编码蛋白结合。应用GST pull-down技术检测到ENO 1与HCMV UL55相互结合的蛋白条带。成功地筛选出10种与UL55蛋白相互结合的宿主蛋白,GST pull-down实验进一步表明ENO 1可以与HCMV UL55蛋白直接结合,为进一步研究UL55蛋白的功能提供了新的线索。