应用BXD小鼠鉴定肾脏发育相关QTLs

[目的]利用BXD小鼠群体定位肾脏发育相关QTLs及筛选QTLs区段内的候选功能基因。[方法]高脂饲喂BXD小鼠29w龄后,获取各品系小鼠肾脏重量和体重,结合该小鼠群体基因型信息,利用web QTL定位肾重比相关QTLs。为进一步筛选QTLs区段内的功能基因,首先,通过皮尔逊相关性分析,鉴定肾脏mRNA表达水平与肾重比显著相关(P 0. 05)的基因;其次,通过比较C57BL/6J和DBA/2J亲本品系的DNA序列信息,鉴定含有非同义突变的蛋白编码基因;最后,将上述基因导入到Phenolyzer在线分析数据库,并以"kidney"为表型关键词进行检索,优选QTLs区段内的候选功能基因。[结果]BXD小鼠肾重比存在显著差异。经QTL作图,在基因组上共鉴定3个与肾重比相关的QTLs,分别位于四号和X染色体上。在QTLs区段内,共发现45个基因的肾脏mRNA表达水平与肾重比显著相关(P 0. 05),65个基因含有非同义突变,经Phenolyzer在线数据库分析,发现51个基因可能与肾脏发育或肾脏疾病相关。[结论]通过QTL作图,在小鼠基因组上鉴定了3个影响肾脏发育的QTLs,筛选了部分候选基因,后续可做进一步的功能验证来阐明其参与肾脏发育的调控机制。     

血小板、红细胞生成素双功能融合蛋白的构建

为探索TPO- EPO融合蛋白在肿瘤化疗中作为辅助治疗药物 ,同时纠正红细胞贫血和血小板减少症的可能性 ,首先通过PCR分别扩增了TPON -端 1 5 3肽和EPO成熟肽的编码cDNA ,并构建成功TPO -EPO融合基因 .融合基因在COS- 7细胞和CHO细胞中的表达产物能够维持TPO依赖株Ba/F3 mpl细胞和EPO依赖株Bet -2细胞的生长 ,能够在半固体培养体系中刺激巨核系集落和红系集落的形成 ,表明它同时具有TPO和EPO的生物活性 .初步体内实验表明 ,含有融合蛋白的培养上清可以使小鼠血小板数目升高 40 % ,对红细胞的作用有待进一步确定 .以上结果初步表明融合蛋白构建成功 ,为进一步探讨融合蛋白的体内活性和应用前景打下了基础 .     

化学合成的EPO对贫血有更好的疗效

ScienceNews 2 0 0 3年 16 3卷 7期 10 9页报道 :已知人类肾脏中制造的天然蛋白红细胞生成素 (EPO)可用作调控人体内红细胞生成的激素。但目前大部分EPO是利用基因工程技术生产的。近据美国加利福尼亚州南圣弗郎西斯科市GryphonTherapeutis公司的科学家GerdKochendoerfer宣称 :     

EPO,EPOR及其信号传递研究进展

EPO(Erythropoietin,促红细胞生成素)是促进哺乳动物红系祖细胞增殖和分化的主要细胞团子。EPO与红系祖细胞表面的EPOR(EPO Receptor)结合后,通过信号传递使细胞核内特定基因转录发生改变。与其它造血生长因子不同,EPO主要作用于相对成熟的红系细胞。近年来,随着对人和动物的EPOR分子克隆以及EPOR突变体分析,使我们对EPO与EPOR的相互作用及其信号传递路径有了比较深入的了解。     

促红细胞生成素基因修饰的胎肝基质细胞促进脐血CD34 +细胞向红系分化

通过重组慢病毒系统感染人胎肝基质细胞(fetal liver stromal cells,FLSCs),建立了能够稳定高效表达促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的细胞株EPO/FLSCs.从胎儿肝脏克隆EPO基因,构建重组慢病毒EPO的表达载体,感染FLSCs,根据荧光表达强弱进行流式分选,获得能够继续稳定传代的高表达EPO基因的FLSCs,RT-PCR和ELISA结果证实,细胞株中的EPO基因稳定表达.RT-PCR结果显示,FLSCs的EPO在mRNA水平的表达分别是未转染FLSCs和转染空载体FLSCs的5.63倍和5.71倍.ELISA法检测了转染重组慢病毒EPO表达载体的FLSCs EPO蛋白表达水平,结果显示EPO蛋白的表达水平也明显升高.收集EPO/FLSCs的条件培养基,体外诱导脐血CD34+细胞向造血细胞分化,结果显示向红系定向分化的细胞比例明显居多,有可能为临床细胞治疗提供稳定、高质量的细胞来源.     

重组促红细胞生成素(rHu-EPO)及其应用

19世纪,法国生理学家 Paul Verte 发现低氧可以刺激血红细胞生长。1950年美国 Reissman 证实了体内存在一种能刺激血红细胞的物质,称为红细胞生成素(EPO)。1985年,美国的 Fritsch 等成功地从成百上千的基因中发现了能产生 EPO 的一种,运用遗传工程,得以从动物细胞中产生对人类 EPO 负责的基因,从而使大量生产 rHuEPO 成为可能。EPO 是由肾脏分泌的一种重要激素,它具有促进骨髓中红细胞系列的增殖、分化、成熟和释放作用,以及维持血中细胞数和血红蛋白量的稳定状态慢性肾功能衰竭(CRF)的贫血与许多因素有关,这些因素包括:促红细胞生成素(EPO)生成减少、血中存在红细胞生成抑制因子(Inhibitors of Erythropoicsis,IE)、红细胞寿命缩     

低氧预适应对小鼠海马组织HIF-1与EPO低氧应答元件结合活性的影响

目的：观察低氧预适应对小鼠海马组织HIF-1与EPO的低氧应答元件（HRE）结合活性的变化,探讨这种变化与低氧预适应形成的关系。方法：小鼠低氧0次（H0）,1次（H1）,4次（H4）后取海马组织,应用凝胶迁移改变试验（EMSA）,染色体免疫共沉淀（ChIP）试验和荧光定量PCR（real—time PCR）技术,检测小鼠海马组织内HIF-1与EPO的低氧应答元件结合能力的变化。结果：EMSA体外结合实验及ChIP体内结合实验发现。H0、H1和H4组结合活力依次增强。结论：HIF-1与EPO的低氧应答元件结合增强可能参与预适应的形成。     

银杏内酯B和低氧预适应对小鼠急性缺氧损伤的保护作用

目的：通过观察缺氧预适应和银杏内酯B预处理对小鼠急性缺氧的影响,了解银杏内酯B的脑保护作用。方法：采用小鼠常压缺氧模型,观察小鼠的行为学并记录各组小鼠的最后死亡时间,脑组织含水量,用RT-PCR、Western blot分别检测各组小鼠皮层组织中RTP801mRNA表达和EPO蛋白表达。结果：银杏内酯B和低氧预适应均能明显延长常压缺氧小鼠的存活时间,降低脑水肿程度,并且银杏内酯组和低氧预适应组RTP801mRNA表达和EPO的表达均明显增加。结论：银杏内酯B与低氧预适应具有相类似的对抗小鼠急性低氧的作用,其脑保护作用与上调RTPS01mRNA和EPO蛋白的表达有关。     

小鼠新基因Ayu17-449的克隆及表达分析

在利用PU8捕获载体从小鼠ES细胞中寻找有关对发育起重要作用基因时,一阳性ES克隆编号为Ayu17-449被捕获,经过Southern blotting法证实捕获载体单一整合在Ayu17-449号ES细胞的基因组中。通过用5＇RACE法得到所捕获基因的一小段cDNA,在EST数据库中比对,得到一5523bp cDNA序列,在Celera数据库中它包含于两个相邻基因,根据这两个基因的mRNA设立了一系列的引物进行RT-PCR和测序,用这两个基因的不同片段分别作探针进行Northern blotting分析,确定这是一个RNA约9kb并编码1920个氨基酸的新基因（定名为Ayu17-449基因,其cDNA序列和编码蛋白序列发表在NCBI数据库,编号为DQ079067）。Northern blotting揭示Ayu17-449基因高度表达在小鼠的脑、肾脏、心脏、肺、肌肉和胃等组织。PU8捕获载体具有X-gal报告基因,能从蛋白表达水平揭示它所捕获的基因的表达模式。X-gal染色结果显示,Ayu17-449蛋白高度表达在小鼠的脑、肾脏、心脏等组织,与Northern blotting法的结果高度一致。X-gal染色切片结果进一步证明Ayu17-449蛋白主要表达在脑的神经细胞和肾脏近曲小管细胞中。Ayu17-449基因的编码蛋白在数据库（Scansite,http：//scansite．mit．edu/）做功能基团分析后,揭示其编码蛋白的N末端含有Granin基团,大量文献证实Granin基团具有参与激素的分泌的功能,显示Ayu17-449基因可能与激素的分泌有关。     

人促红细胞生成素cDNA逆转录病毒载体的构建及在NIH3T3和CHO细胞中的表达

贫血是慢性肾衰病人常见的症状,其发生的主要原因之一是由于肾脏表达促红细胞生成素(EPO)的量减少。输入基因工程重组的人EPO可以有效地改善病人的症状。由于在体内只有完全糖基化的EPO才有生理活性,所以目前临床所用EPO均来自工程化的哺乳动物细胞,价格昂贵。随着基因治疗研究的进展,人们设想可以采用基因治疗的方法,在体内表达一些有治疗作用的蛋白质,有可能解决目前蛋白     

EPO对肾脏缺血再灌注损伤大鼠肺内氧化应激状态的影响

目的:探讨促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对大鼠肾脏再灌注损伤模型肺内氧化应激状态的影响。方法:清洁级Sprague-Dawly(SD)大鼠36只适应性喂养1周后,随机分为3组,即假手术组(A组)、肾脏再灌注损伤组(B组)和EPO预处理组(C组),每组12只。A组大鼠只打开腹腔,游离双侧肾蒂但不夹闭;B组与C组都建立了大鼠肾脏再灌注损伤模型,且C组在夹闭肾蒂前2 h腹腔注射人重组EPO(5000 U/kg)。术后24 h,处死大鼠,检测肺内氧化应激水平。结果:A组大鼠精神状态良好,肾小管结构正常,未见明显上皮细胞肿胀、脱落,肺泡结构基本完整,肺泡间隔未增厚,有少量炎性细胞浸润;B组鼠毛耸立,无光泽,饮水量减少,肾小管结构破坏消失,肾小管扩张,可见大量蛋白管型,肺泡结构破坏,肺泡腔缩窄,肺泡间隔增厚,组织水肿,大量炎性细胞浸润;C组大鼠精神状态有所恢复,一般状况尚可,肾小管损伤较B组轻似,肾小管坏死区域有所减少,坏死偶见,肺泡壁轻度破坏,结构较为清晰,可见少量炎性细胞浸润。B组与C组大鼠的血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)与血肌酐(serum creatinine,Scr)水平、肺组织血红素氧合酶(heme oxygenase, HO)-1与丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平都显著高于A组,C组以上指标均显著低于B组(P0.05)。B组超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的水平均显著高于A组(均P0.05),而C组SOD和GSH-Px的水平均显著高于B组(均P0.05),A组与C组间对比无显著差异。结论:EPO用于大鼠肾脏再灌注损伤模型能缓解肺内氧化应激状态,促进肾功能及肺组织恢复,发挥肾脏保护作用。     

乙型肝炎表面抗原阳性转基因小鼠肝组织基因表达谱及蛋白组学的初步研究

目的 利用与乙型肝炎病毒(ItBV)携带者相类似的#59系HBV转基因小鼠动物模型研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)蛋白对肝组织生理、代谢状态的影响,以了解HBsAg持续表达对肝细胞影响的机制。方法 用Affmertix基因芯片观察转基因小鼠肝组织基因表达谱的改变。用蛋白组学方法鉴定部分代谢相关酶类在转基因小鼠肝组织内的丰度改变。结果 基因芯片实验显示43个基因在转基因小鼠肝组织内显著(≥2倍)上调表达,104个基因显著下调表达。蛋白组学实验检出18个代谢相关酶在转基因小鼠肝组织内丰度高于对照鼠1．5倍以上,9个代谢相关酶低于对照鼠1．5倍以上。结论 HBV蛋白的存在对宿主肝组织代谢状态产生显著影响。推测其表现为胆固醇合成增强、胆汁酸合成减弱。糖异生作用增强、糖酵解减弱。氨基酸分解代谢增强、尿素合成减弱。     

血管生成素样蛋白2在糖尿病肾病小鼠肾脏中的表达研究

利用半定量RT-PCR和免疫组化的方法同时从mRNA水平和蛋白质水平对血管生成素样蛋白2在不同病理阶段的2型糖尿病肾病模型小鼠--db/db小鼠肾脏中的表达情况进行了较为系统的分析.结果发现:a.在糖尿病前的db/db小鼠(4周龄的db/db小鼠),血管生成素样蛋白2与作为正常对照的db/m小鼠相比,差异不是很大,随着肥胖的加剧,高血糖、蛋白尿的出现,血管生成素样蛋白2在db/db小鼠肾脏中的表达无论从mRNA水平还是从蛋白质水平均显著升高.b.从免疫组化的分析结果来看,血管生成素样蛋白2主要分布于小鼠肾脏的肾小球部分,主要是沿毛细血管袢呈线性分布,其位置与足细胞的位置重叠,足细胞是小鼠肾脏中血管生成素样蛋白2的主要分泌细胞.c.小鼠肾脏血管生成素样蛋白2的表达水平似乎还与鼠龄相关:虽然变化幅度不是很大,但在周龄较大的小鼠(如20周龄以上),其表达水平相对较高.上述工作不仅印证了先前对2型糖尿病肾病患者肾小球基因表达谱的分析结果,更加明确了血管生成素样蛋白2与糖尿病肾病的相关性,同时揭示了血管生成素样蛋白2在正常小鼠和糖尿病肾病小鼠肾脏中的表达、分布和变化规律,有利于进一步揭示血管生成素样蛋白2的功能及其在糖尿病肾病发生、发展过程中的可能作用,探讨糖尿病肾病的分子机制.     

人SP-B蛋白转基因小鼠及细菌性肺炎模型的构建

目的:构建携带人SP-B蛋白+1580 SNP不同等位基因的转基因小鼠并进行细菌性肺炎模型的造模。方法:利用受精卵原核注射技术将hSP-B基因整合至小鼠染色体上获得F0代小鼠,将其与mSP-B基因敲除鼠进行交配,逐步去除转基因小鼠体内m SP-B基因。利用PCR技术鉴定小鼠基因型,通过测序确定+1580位点的等位基因。将铜绿假单胞菌经支气管灌注接种至小鼠肺内进行细菌性肺炎造模,对照组注射等量灭菌生理盐水。结果:F2代小鼠只表达人SP-B蛋白而不表达鼠SP-B蛋白,蛋白表达量与人肺内含量相近,即为构建成功的转基因小鼠。3个小鼠家系+1580位点等位基因为T,1个家系为C。细菌接种(1×10~6CFU/mouse)后24小时,小鼠肺泡内炎症渗出明显,大量中性粒细胞浸润,SP-B蛋白含量明显降低,但不同等位基因间在此条件下无明显差异。结果:成功构建只表达人SP-B蛋白的转基因小鼠模型,细菌性肺炎模型造模成功,为今后进一步研究人SP-B蛋白的生理功能及+1580基因多态性与肺疾病的关系提供了有力的工具。     

小鼠锌指蛋白基因ZF-12基因剔除的ES细胞系的建立

利用小鼠锌指蛋白ZF－12基因组DNA片段,构建了针对小鼠ZF－12基因座的替换型打靶载体pSSC-TV-10.5。经限制性核酸内切酶酶切及部分测序鉴定其结构正确后,通过电穿孔将线性化打靶载体导入ES人,经G418／GANC双药筛选和分子鉴定,获得4个ZF－12^ /-基因的ES细胞杂合子克隆,其生长状态良好,为进一步建立ZF－12基因剔除的小鼠动物模型创造了条件。     

性别及日龄对转人神经生长因子基因小鼠唾液中蛋白分泌的影响

神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)是一种能促进神经元发育、分化、再生的蛋白。为高效生产药效更佳的人源NGF (hNGF)药物,最近,笔者实验室构建出唾液腺特异表达hNGF的转基因小鼠,并从该转基因小鼠唾液中纯化获得具有高生物学活性的h NGF蛋白。为了选择性别和日龄最适宜的转hNGF基因小鼠用于收集纯化hNGF蛋白,文中比较了28日龄(性成熟前)雄性、雌性,63日龄(性成熟后)雄性、雌性转hNGF基因小鼠,共4组转hNGF基因小鼠分泌的唾液量、唾液总蛋白量、唾液鼠源NGF (mNGF)蛋白量和唾液h NGF蛋白量等指标。结果显示,63日龄的转hNGF基因小鼠分泌的唾液量、唾液总蛋白量、唾液mNGF蛋白量和唾液hNGF蛋白量显著高于28日龄同一性别的转hNGF基因小鼠,且63日龄的雄性转hNGF基因小鼠分泌的唾液hNGF蛋白量显著高于同一日龄的雌性转hNGF基因小鼠;在4组小鼠中,63日龄的雄性转hNGF基因小鼠分泌的唾液hNGF含量最高,比28日龄雌性转hNGF基因小鼠高出约46倍,最适宜用于收集唾液并从中纯化hNGF。     

ES小鼠和ES细胞中H19基因甲基化状态

为探讨印迹基因H19的甲基化状态与ES小鼠胚胎发育之间的关系, 以遗传背景相同的正常成年对照小鼠、22只成年ES小鼠和8只新生死亡的ES小鼠以及不同传代次数的ES细胞为实验材料, 利用甲基化敏感性限制性内切酶-PCR技术分别检测了其印迹基因H19的5′非翻译区两个位点的甲基化状态。结果表明, 发育至成年的ES小鼠印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与正常成年对照小鼠之间没有差异, 而新生死亡的ES小鼠印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与成年ES小鼠以及正常成年对照小鼠相比则存在明显差异。推测ES细胞中印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与成年ES小鼠以及正常成年对照小鼠之间可能存在 差异。     

水动力转染技术的应用进展

水动力转染技术是一种快速、方便、高效的外源基因转染方法,是指通过小鼠尾静脉快速注射大体积含有目的基因的生理盐水,从而实现外源目的基因在小鼠体内的高效表达。此方法在肝脏疾病、糖尿病、心肌炎、肾脏疾病和抗肿瘤等实验动物模型的研究以及这些疾病的基因免疫疗法的研究中已有应用。此外,水动力转染技术在对活体动物基因功能、基因调节、蛋白表达以及基因治疗等方面也有广泛应用。