初学者做好蛋白质SDS—PAGE需要注意的一些问题

针对初学者在做蛋白质SDS—PAGE时经常遇到的一些问题提出了一些切实可行的解决办法。     

胚胎骨Ⅰ型胶原的提取与鉴定

应用酸性、中性交互提取法从人胚骨中提取Ⅰ型胶原,经SDS-PAGE电泳,氨基酸分析和免疫学方法鉴定．结果表明所提胶原电泳区带与Ⅰ型标准品相同,环状沉淀反应阳性,氨基酸分析甘氨酸占1000个氨基酸总残基的1/3,羟脯氨酸与脯氨酸之比为0.65,符合Ⅰ型胶原特征,并显示有较高的纯度,可用于胶原制品的制作．     

人胎盘中胶原蛋白的提取和表征

采用碱-酶结合法以人胎盘为原料提取胶原蛋白,并使用原子力显微镜(AFM)、差示扫描量热仪(DSC)、圆二色光谱(CD)和傅立叶变换红外光谱(FTIR)对所得胶原蛋白产品进行表征。结果表明:此工艺路线的胶原蛋白得率高,达到0.102%;提取时间由48 h以上减少到24 h以内,而且所得胶原蛋白分子完整地保留了其螺旋纤维结构。此法是从人胎盘中提取胶原蛋白的一种行之有效的方法。     

蛋白质组分析中蛋白质分步提取方法的建立

利用细胞裂解液充分溶解细胞蛋白质是成功进行蛋白质组分析的先决条件.尝试利用三步提取法,即以三种溶解性能不同的裂解液分步提取细胞中的蛋白质组,并分别进行二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2-D PAGE）分离.通过对2-D PAGE蛋白质图谱的比较,发现其与常规方法相比,具有蛋白质提取率高、双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)分辨率高等优点.     

木本植物蛋白提取和SDS-PAGE分析方法的比较和优化

在几种木本植物上对４种常用蛋白提取方法、４种凝胶染色和脱色方法及影响蛋白定量和ＳＤＳＰＡＧＥ电泳的因素进行了比较研究,发现：利用改良丙酮沉降法提取蛋白,不仅提取效率高,而且杂质干扰少,得到的电泳结果,蛋白条带清晰,数量多;将常规凝胶染色和脱色液中的乙醇改用为甲醇可大大改善染色和脱色效果,获得了没有背景或背景很浅的电泳结果。通过研究确定了一套优化的适用于木本植物的蛋白提取、定量、凝胶制备、电泳、染色、脱色以及干胶制备的方法。利用这一优化方法对胡杨细胞盐胁迫蛋白进行了研究,发现了与高水平盐胁迫有关的６６ｋＤ蛋白和与盐胁迫和干旱胁迫均有关的２８ｋＤ蛋白,获得了满意的蛋白ＳＤＳＰＡＧＥ分析结果。     

木本植物蛋白提取和SDS-PACE分析方法的比较和优化

在几种木本植物上对4种常用蛋白提取方法、4种凝胶染色和脱色方法及影响蛋白定量和SDS-PAGE电泳的因素进行了比较研究,发现：利用改良丙酮沉降法提取蛋白,不仅提取效率高,而且杂质干扰少,得到的电泳结果,蛋白条带清晰,数量多;将常规凝胶染色和脱色液中的乙醇改用为甲醇可大大改善染色和脱色效果,获得了没有背景或背景很浅的电泳结果。通过研究确定了一套优化的适用于木本植物的蛋白提取、定量、凝胶制备、电泳、染色、脱色以及干胶制备的方法。利用这一优化方法对胡杨细胞盐胁迫蛋白进行了研究,发现了与高水平盐胁迫有关的66kD蛋白和与盐胁迫和干旱胁迫均有关的28kD蛋白,获得了满意的蛋白SDS-PAGE分析结果。     

SDS-PAGE分析肝癌细胞和正常肝细胞膜蛋白

目的:采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法获得肝癌细胞株HepG2和人正常肝细胞株L-02蛋白质表达谱,期待找到与肝癌细胞相关的差异蛋白。方法:体外培养肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株L-02,分离提取细胞膜蛋白,用SDS-PAGE分析细胞膜蛋白。结果:2种细胞膜蛋白的疏水相和亲水相蛋白区带位置基本相同,但肝癌细胞株HepG2膜蛋白在相对分子质量66×103处有较清晰的异常蛋白区带。结论:肝癌细胞HepG2除了具有与正常肝细胞相同的组成物质外,还有自己独特的蛋白质表达谱,这一实验可为癌症的研究提供一定的参考。     

聚丙烯酰胺凝胶电泳的快速脱色方法

以牛血清白蛋白为材料进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),凝胶固定后,用考马斯亮蓝R-250染色后比较传统脱色液(冰乙酸-甲醇溶液)和不同盐溶液(NACL、KCL、CUCL2)的脱色效果的结果表明:PAGE和SDS-PAGE胶,0.25和0.5MOL·L-1NACL,在70℃(PAGE)、50℃(SDS-PAGE)下脱色,约2￣4H,效果好,灵敏度高,背景低。     

人Ⅳ型胶原的提纯及其抗血清制备

采用胃蛋白酶限制性消化,NaCl分级盐析,还原和烷基化反应,纤维素离子交换层析从人胎盘组织分离纯化Ⅳ型胶原.经SDS-PAGE电泳鉴定符合Ⅳ型胶原α肽链电泳带.用纯化的Ⅳ型胶原免疫兔制备出高效价的特异抗血清.     

检测SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中家蝇蛋白的新方法——海波银染法

介绍一种检测SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中家蝇幼虫蛋白的新方法-海波银染法。该方法对传统银染方法中的试剂与步骤加以改进,省略了乙醇固定与洗涤步骤,只需20 min即可完成全部染色过程,且仅在国产分析纯试剂及普通操作条件下,灵敏度可达毫微克级水平。     

微量蛋白检测中不同银染方法的比较与分析

随着生物化学技术的不断发展,作为检测SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中微量蛋白的银染方法也在不断改进和发展.采用4种不同的银染方法检测不同含量的牛血清白蛋白,结果显示单纯的银染过程中如果使用戊二醛固定会使蛋白检出更快速灵敏,而结合考马斯亮蓝的复合银染则较单纯银染灵敏度提高了5～7个数量级.     

一种利于蛋白质回收的快速SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色-脱色方法

在实践基础上摸索出一种快速并有利于蛋白质回收的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色-脱色方法：经常用的考马斯亮蓝R-250染色液短暂染色后直接用250 mmol/L KCl溶液脱色.这种方法染色-脱色的清晰程度与常规的染色-脱色方法接近,而且能使蛋白质回收率提高三倍多.     

一种水稻幼苗单株DNA的快速提取及PAGE银染改良法

目的:为了提高SSR分子标记技术在水稻遗传育种中的研究效率,介绍一种快速的适于SSR-PCR扩增的水稻幼苗单株DNA提取法及PAGE银染法。方法:在常温下加入少量SDS提取液将单株叶片迅速捣碎,再加入300μLSDS提取液,65℃水浴10min后离心,取上清用乙醇沉淀后离心,超净工作台吹干后用100μLTE回溶即可。改进的PAGE银染法只需染色、冲洗、显影等3步,用乙醇和硝酸银作为染色液,去离子水快速冲洗1次后置显影液中即可显影。结果:本法可快速提取DNA,不须液氮研磨、氯仿抽提,提取的DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测表明质量较好,且扩增结果稳定可靠,满足了SSR-PCR的需要。改良的银染法与常规银染法的检出结果相同,但快速方便,整个过程只需10min,且背景较浅,灵敏度高。结论:快速提取法及PAGE银染改良法结合SSR分子标记技术,可有效地用于杂种后代的遗传连锁分析和分子标记辅助育种时的单株检测。     

牛凝血酶等电点的初步测定

作为一种新型的速效局部止血药和工具酶,凝血酶在临床和生物学研究中的应用十分广泛,牛血浆是其重要的来源之一。等电点沉淀是提取牛凝血酶首要和关键的步骤,测定其等电点后,再用此法时将得到更纯的凝血酶粗制品。本实验的目的是采用载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳的方法,结合SDS-PAGE测定牛凝血酶的等电点。经双向电泳后,SDS聚丙烯酰胺凝胶中出现了4个清晰的斑点,分别测定它们的分子量和等电点, 其中一个斑点与牛凝血酶B链的分子量一致为32kDa,其等电点为5．19．     

艾氏腹水癌患鼠腹水中一种高分子量DNA结合蛋白的分离

 本文利用免疫吸收法和免疫亲和层析法,从艾氏腹水癌患鼠腹水DNA结合蛋白中,分离得到了一种高分子量DNA结合蛋白。在免疫双扩散反应中,它与抗艾氏腹水癌患鼠血清DNA结合蛋白的兎抗血清反应形成一条沉淀线,但与正常小鼠血清DNA结合蛋白的兎抗血清不形成沉淀线。该DNA结合蛋白样品用2-巯基乙醇还原后,经SDC-PAGE分析,测得其分子量约为41000。     

快速提取、纯化叶绿体4.5SrRNA的方法

我们采用植物叶与热缓冲液、苯酚直接混合(约65℃)匀浆,离心抽提和乙醇沉淀后,得到植物叶总RNA。经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、纯化,即可得到叶绿体4.5S rRNA,此法不仅操作简单,而且得率高。 同时,经过对同一植物的不同组织或不同细胞组分,如根、细胞质、叶绿体和叶绿体核糖体小分子RNA的提取与鉴定,以简便的方法证明了4.5S rRNA是叶绿体核糖体成份,也证明了我们所采用的提取、纯化4.5SrRNA方法的可靠性。     

实验性石棉肺病变中Ⅰ型及Ⅲ型胶原基因表达的研究

以斑点杂交法测定染溫石棉尘后30天与60天大鼠肺组织中前胶原mRNA的水平,即proα_1(Ⅰ)、proα_2(Ⅰ)、proα_1(Ⅲ)mRNA的水平,并与正常大鼠肺组织对比,结果显示,染石棉尘的肺组织中这三种mRNA显著地高于正常对照组。在染尘后60天时Ⅰ型胶原的两种mRNA仍呈上升趋势,而Ⅲ型胶原的mRNA则呈稳定状态。体外实验的结果表明溫石棉及青石棉纤维都可以刺激2BS细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的表达。矽肺组织来源的致纤维化因子与石棉纤维都具有促进胶原基因表达的作用,其共同作用效果更強。证明这两种因素都参与调节石棉肺的纤维化作用。     

生物学知识及相关实验方法理解之“微”视角CSCD

教材中生物学知识及相关实验方法往往从宏观角度进行介绍和解释,其中一些让学生难以理解。应用微分思想可以帮助解决这些问题。本文介绍了几个例子,希望能给大家提供参考。