胚胎大鼠脑和脊髓神经干细胞的分离和培养

研究采用显微解剖、无血清细胞培养和免疫荧光细胞化学染色等实验技术 ,成功地建立了胚胎大鼠脑和脊髓神经干细胞 (NSCs)的分离和培养方法。结果显示 ,( 1)在含成纤维细胞生长因子 2 (FGF 2 )和表皮生长因子(EGF)的无血清培养液中 ,两种来源的NSCs经体外培养 8- 10代后 ,其细胞数呈指数级增加 ,其中脑来源的NSCs数由原代培养时的 1× 10 6 增加至 1× 10 12 ,脊髓来源的NSCs数从 1× 10 6 增加至 1× 10 11。增殖的细胞表达神经上皮干细胞蛋白 (nestin) ;( 2 )在含 1%胎牛血清 (FBS)的培养条件下 ,它们都能被诱导分化为神经元、少突胶质细胞和星型胶质细胞。但其分化比例可随细胞传代次数的增加而改变 ,其中 ,大脑来源的NSCs分化为神经元的比例从第二代 (P2 )的 11 95± 2 5 %下降至第五代 (P5)的 1 97± 1 16% (P <0 0 1) ,而少突胶质细胞的分化比例则基本保持不变 ,这一分化格局同样可在脊髓来源的NSCs中发现。结果表明 ,我们所分离和培养的细胞在体外经多次传代后仍具有很强的增殖能力和多向分化潜能 ,它们都表达nestin ,属于中枢神经系统的干细胞     

小鼠胚胎神经干细胞的分离培养及其鉴定

且的探索小鼠胚胎神经干细胞的体外培养方法,并获取高纯度的神经干细胞,为神经干细胞的深入研究提供实验材料。方法无菌条件下分离E15天小鼠胚脑皮质,制成单细胞悬液,在bFGF和B27存在的培养基中培养扩增,通过免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向。结果培养的部分细胞在B27和bFGF存在的无血清培养基中可以在体外分裂增殖,同时表达神经干细胞特异性抗原nestin,并在撤出B27和bFGF的有血清培养基中向神经细胞和胶质细胞分化。结论小鼠胚脑皮质存在具有多向分化潜能的神经干细胞,这些细胞可以在体外稳定培养、传代并自然分化,为细胞替代治疗提供了理想的细胞来源。     

神经干细胞分离培养方法的介绍

在成体的许多组织中发现了多能干细胞,这些干细胞可以进行自我复制,参与组织的正常修复。神经干细胞在体外能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,并具有多向分化潜能。成体神经干细胞和胚胎干细胞都能分化成成体神经系统中的各种神经细胞。神经干细胞具有自我更新能力,因此神经干细胞可以应用于神经损伤或者神经疾病的修复。本文概述了神经干细胞体外分离培养的方法及其生长影响因子。     

兔胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴别

目的：研究兔胎脑神经干细胞体外生长特性,为探讨神经干细胞的临床应用及神经系统的发育奠定基础。方法：采用含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的N2无血清培养技术,取18天龄兔胚胎脑组织,分离神经干细胞,并观察分离的细胞体外培养、增殖、分化潜能,免疫组化鉴定。结果：从18天龄兔胎脑皮质和纹状体中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈半贴壁状态生长,形成神经球,可传代。细胞呈Nestin免疫反应阳性;在含血清培养基中培养时则分化,分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论：来自兔胎脑神经干细胞能在体外培养、增殖并保持传代能力。无血清N2EGF、bFGF培养基有利于兔胎脑神经干细胞的存活和增殖,含血清培养基能诱导兔胎脑神经干细胞分化。     

猪神经干细胞分离培养研究进展

神经干细胞用于神经学临床修复和基础理论研究的前提是首先完成神经干细胞的体外分离、培养、纯化并大量扩增。鼠、人、猪中都已成功分离出神经干细胞并已尝试用于动物神经系统损伤等疾病的治疗,尽管在鼠和人上的研究很多,相对于鼠神经干细胞在神经学临床应用上的局限和人神经干细胞在材料来源上的不便,猪作为神经干细胞临床应用和基础研究的模式动物有很大的潜力。但关于猪神经干细胞体外分离培养的研究非常少,本文对这方面的研究进展做一综述。     

山羊胚胎大脑皮层神经干细胞分离、培养与鉴定

目的 :从山羊胚胎大脑皮层中分离培养并鉴定神经干细胞。方法 :利用NBS培养和单细胞克隆技术在山羊胚胎大脑皮层中分离出具有单细胞克隆能力的细胞 ,并进行培养、传代、分化观察 ,采用免疫组化检测克隆细胞的神经巢蛋白 (Nestin)抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。结果 :从胚龄 2 4～ 30d的新鲜山羊胚胎大脑皮层中成功分离出神经干细胞 ,该细胞具有连续克隆能力 ,可传代培养 ,表达神经巢蛋白抗原。分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论 :山羊胚胎大脑皮层中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞。     

小鼠胚胎干细胞的培养

ＥＳ细胞的培养应满足促进细胞增殖和抑制细胞分化而保持其高度未分化潜能。我们用胚胎成纤维细胞作为饲养层,培养基ＤＭＥＭ中加白血病抑制因子的方法来培养ＥＳ细胞。培养的ＥＳ细胞呈集落状生长,细胞排列紧密,呈未分化状态。胚胎成纤维细胞作为饲养层是分离培养ＥＳ细胞最普遍使用而且有效的方法。本文还围绕ＥＳ细胞培养中的促进增殖和抑制分化这两个方面的影响因素进行了讨论。     

胚胎干细胞的分离与培养

如何分离胚胎干细胞，并在体外进行分化抑制培养，仍是探索性很强的研究课题，本文简述了胚胎干细胞分离培养方法的主要进展与趋势。     

人胚胎干细胞分化为神经干细胞诱导方法的对比研究

目的探讨人胚胎干细胞分化为神经干细胞过程中,经拟胚体（embryonic body,EB）法和直接分化法的不同效率。方法人胚胎干细胞常规培养消化后,分为两组：A组,经EB法分化;B组,添加noggin和ITSFn直接分化法。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,RT-PCR检测细胞各阶段标志物,免疫荧光及流式细胞仪观察两组细胞Nestin阳性细胞率。神经干细胞继续分化,免疫荧光、RT-PCR法检测MAP2、GFAP表达。结果RT-PCR检测到OCT4、nestin表达。B组nestin阳性细胞率明显高于A组,差异有统计学意义（P〈0.01）,且诱导周期短于A组。神经干细胞继续分化,得到不同数量的神经元和胶质细胞,MAP2、GFAP分别阳性。结论在体外采用定向分化诱导,人胚胎干细胞不经EB,可直接定向分化为神经干细胞,且诱导效率比EB法高。因此直接分化法是一种经济实用的诱导方法。     

新生大鼠脊髓神经干细胞的分离培养及鉴定

目的　从新生大鼠的脊髓中分离培养神经干细胞并观察其增殖和分化能力。方法　采用细胞培养技术结合间接免疫荧光细胞化学法。结果　分离的细胞生长旺盛 ,单克隆化生成的细胞团 ,BrdU掺入呈强阳性。分离培养获得的细胞团呈Nestin强阳性 ,至今已在体外连续传代 8个月。培养的细胞团经 1%小牛血清诱导可分化为神经元和星形胶质细胞。结论　成功分离培养了新生大鼠脊髓神经干细胞     

胎鼠脊髓源性神经干细胞分离培养与鉴定

目的:研究胎鼠的脊髓源性神经干细胞的分离培养方法并观察其增殖和分化能力。方法:利用显微操作技术分离获得胎鼠脊髓组织、无血清培养技术和酶消化法结合机械法传代培养神经干细胞、免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞和分化情况。结果:建立了胎鼠脊髓源性神经干细胞的分离、培养和鉴定的方法,观察到了脊髓源性神经干细胞具有较强的增殖能力,在添加有5ng／mlEGF和5ng／mlbFGF的无血清培养液中可贴壁分化为神经元、少突细胞和星形胶质细胞。结论:在体外培养条件下分离培养的胎鼠脊髓源性神经干细胞具有干细胞的特性即较强的增殖能力和多向分化潜能。     

小鼠胚胎干细胞在单层粘附培养中向神经细胞的分化

目的 :探讨小鼠胚胎干 (ES)细胞在无血清培养基中以单层粘附培养方式向神经分化的方法。方法 :比较ES细胞在不同培养基中的生长情况 ,分析ES细胞在不同时间分化形成神经细胞的比例。结果 :( 1 )DMEM F1 2和Neurobasal B2 7的 1∶1混合培养基最适合ES的生长。 ( 2 )单层粘附的ES细胞表达神经细胞粘附分子 (NCAM)的比例随时间增长而增加 ,而nestin的表达先增加后下降。 ( 3)ES细胞可在两周分化为神经胶质及神经元 ,形成神经网络。结论 :小鼠ES细胞可在单层粘附培养中获得向神经的高效分化。     

Functional Analysis of Neuron-like Cells Differentiated from Neural Stem Cells Derived from Bone Marrow Stroma Cells in vitro

The transversal differentiation of bone marrow stroma cell (BMSCs) into neural stem cells (NSCs) has attracted much attention in recent years because of their therapeutic potential. However, the problem in therapeutic application of NSCs was how to confirm whether neuron-like cells differentiated from bone marrow stroma cell-derived neural stem cells (BMSCs-D-NSCs) possess corresponding functions of neurochemistry and electrophysiology. In the present study, we tried to affirm the function of neuron-like cells differentiated from BMSCs-D-NSCs in vitro. The BMSCs were harvested by gradient centrifugation in Ficoll-Paque and cultured in “NSCs medium”. Immunocytochemistry was used to detect positive expression of neuron-specific nuclear protein (NeuN) in neuron-like cells derived from the BMSCs-D-NSCs. High-pressure liquid chromatography (HPLC) was used to identify neuron-like cells by detecting excitable amino acids [aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu)], inhibited amino acids [glycine (Gly), gamma (γ) -aminobutyric acid (GABA), alanine (Ala)] or monoamines [noradrenaline (NE), 5-hydroxytryptamine (5-HT), dopamine (DA)]. Electrophysiological properties of the neuron-like cells were also examined using patch clamp analysis to verify their neuron-like functions. It was found that the neuron-like cells differentiated from the BMSCs-D-NSCs could express positive NeuN, synthesize and excrete amino acids, and show some typical electrophysiological properties including the typical Na⁺ and K⁺ ion channel membrane current under the voltage patch clamp condition, the typical static electrical membrane potential under the current patch clamp condition, and the differential membrane capacitance and resistance values in series between undifferentiated BMSCs-D-NSCs and differentiated neuron-like cells under the whole-cell patch clamp condition. The neuron-like cells differentiated from BMSCs-D-NSCs exhibit both neuron-like biochemical function and some corresponding electrophysiological properties.     

Integration and Long Distance Axonal Regeneration in the Central Nervous System from Transplanted Primitive Neural Stem Cells

Spinal cord injury (SCI) results in devastating motor and sensory deficits secondary to disrupted neuronal circuits and poor regenerative potential. Efforts to promote regeneration through cell extrinsic and intrinsic manipulations have met with limited success. Stem cells represent an as yet unrealized therapy in SCI. Recently, we identified novel culture methods to induce and maintain primitive neural stem cells (pNSCs) from human embryonic stem cells. We tested whether transplanted human pNSCs can integrate into the CNS of the developing chick neural tube and injured adult rat spinal cord. Following injection of pNSCs into the developing chick CNS, pNSCs integrated into the dorsal aspects of the neural tube, forming cell clusters that spontaneously differentiated into neurons. Furthermore, following transplantation of pNSCs into the lesioned rat spinal cord, grafted pNSCs survived, differentiated into neurons, and extended long distance axons through the scar tissue at the graft-host interface and into the host spinal cord to form terminal-like structures near host spinal neurons. Together, these findings suggest that pNSCs derived from human embryonic stem cells differentiate into neuronal cell types with the potential to extend axons that associate with circuits of the CNS and, more importantly, provide new insights into CNS integration and axonal regeneration, offering hope for repair in SCI.     

人胚胎干细胞培养体系的研究进展

人胚胎干细胞具有广泛的研究前景,建立一个理想的人胚胎干细胞培养系统是利用它的前提.较详细地对目前关于人胚胎干细胞培养体系的研究进展、一些细胞因子对人胚胎干细胞的作用和影响以及体外长期培养对人胚胎干细胞核型的影响进行了综述.     

神经干细胞三维空间壳聚糖生物材料中培养

目的:体外培养神经干细胞,并将其种植在三维空间壳聚糖材料中,体外培养一段时间,使壳聚糖材料内尽量分布足够多的细胞.方法:将NSCs种植在4不同孔径直径16通道壳聚糖材料中,分别培养7d和14d.DAPI标记细胞.荧光镜下观察细胞在不同孔径直径材料中的分布.MTT法检测不同孔径直径壳聚糖材料内细胞的活性.结果:DAPI荧光显示,培养7d时.细胞仍然成团贴附在材料的通道内,少有细胞迁移至壳聚糖材料内,而培养14d可见细胞较均匀的分布在材料内,同时观察到,孔径直径为0-75μm和75-125μ m两种壳聚糖材料,容纳细胞数较孔径直径为125-200μ m和200-300μm少.MTT结果显示,200-300μ m孔径直径的壳聚糖材料内细胞活性为各组最高,间接提示其内所含细胞数最多,而培养7d和14d两种培养方式对同种孔径直径材料内所含细胞教并无影响.结论:壳聚糖可降解生物材料能显示出良好生物相容性;体外培养NSCs于孔径为200-300μm的壳聚糖材料内14d,其存活细胞多且分布较均匀.