Bt杀虫晶体蛋白基因及其转基因育种研究进展

本文简要介绍了Bt杀虫晶体蛋白及其编码基因,以及目前通过基因工程方法获得的转Bt杀虫晶体蛋白基因植物,着重分析和探讨了目前转Bt杀虫晶体蛋白基因植物及转基因育种研究中存在的一些问题,并就这些问题及合理持续利用Bt杀虫晶体蛋白提出了一些见解。     

Bt杀虫基因与Bt转基因抗虫植物研究进展

苏云金杆菌是一类非常重要的昆虫病原体,它能产生特异性的杀虫结晶蛋白,对农业上和生物医学上的许多有害的昆虫有毒杀作用,这些害虫包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、螨类和线虫。近三十年来,以苏云金杆菌为基础的生物杀虫剂已在世界范围内商业化用于防治重要经济作物的害虫。近年来有关Ｂｔ基因的遗传、分子生物学和基因工程已取得显著进展。本文对苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类和杀虫机理及用该类基因构建的工程转基因植物研究状况作一简要综述,同时对Ｂｔ基因工程存在的潜在问题和解决途径作了简单的探讨。     

Bt杀虫基因与Bt转基因抗虫植物研究进展

苏云金杆菌是一类非常重要的昆虫病原体,它能产生特异性的杀虫结晶蛋白,对农业上和生物医学上的许多有害的昆虫有毒杀作用,这些害虫包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、螨类和线虫。近三十年来,以苏云金杆菌为基础的生物杀虫剂已在世界范围内商业化用于防治重要经济作物的害虫。近年来有关Bt基因的遗传、分子生物学和基因工程已取得显著进展。本文对苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类和杀虫机理及用该类基因构建的工程转基因植物研究状况作一简要综述,同时对Bt基因工程存在的潜在问题和解决途径作了简单的探讨。     

转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达行为

构建了高效植物表达载体ｐＢｉｎＭｏＢｃ,该载体携带超强表达复合启动子ＯＭ及Ω因子控制下的ＣｒｙＩＡ（ｃ）基因。采用根癌土壤杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）Ｃｏｎｎ）介导的方法转化烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）,ＥＬＩＳＡ检测表明,大多数转基因烟草中ＣｒｙＩＡ（ｃ）基因表达量均超过０．１％,最高可达０．２５５％;转基因烟草     

Bt 毒蛋白基因在转基因抗虫植物中的应用

1　引言世界上每年因虫害而造成的农产品损失估计为 13 %。在我国 ,水稻每年因虫害减产 10 %以上 ,小麦减产近 2 0 % ,棉花产量损失达 2 0 %～3 0 % ,如果加上这些农产品在贮藏过程中因虫害而造成的损失则更大。目前 ,农作物保护主要依赖于施用农药 ,从长远利益来看 ,将来必须发展绿色环保型农业 ,以减少能源和化学药剂的投入量 ,并且不会产生药剂残留、环境污染以及害虫的抗药性等问题。基因工程技术的发展克服了常规育种的不足 ,开辟了植物抗病虫害育种的新时代。抗植物虫害的基因有很多 ,目前经常使用的主要有 3种 ,即豇豆胰蛋白酶抑制剂…     

转Bt基因作物杀虫蛋白土壤残留及检测研究进展

随着转Bt基因作物的大面积推广和应用,其释放的毒蛋白在土壤中的残留及对土壤生态系统的影响等问题已经成为人们关注的热点。国内外学者们通过室内构建大田模拟模型的方法对土壤中残留的Bt毒蛋白进行了研究,并取得了显著的进展。土壤是生态系统中物质循环和能量转化过程的主要场所,转Bt基因植物的外源基因表达的Bt毒蛋白可以通过植株残体、根及根系分泌物和花粉的散播等途径进入土壤生态系统,这些高度特化了的Bt毒素蛋白一旦在土壤中积累,将会导致土壤特异生物功能类群以及土壤多样性发生改变,甚至产生级联效应。大量研究表明,苏云金芽孢杆菌产生的Bt毒蛋白进入土壤后,可与土壤粘粒和腐质酸迅速结合,不易分离,而且较之游离态,更难被土壤微生物降解。纯化的Bt毒蛋白与无菌土壤中活性颗粒紧密结合后,存留时间至少可达234d。虽然结合态的Bt蛋白用酶联免疫法(ELISA)方法检测不到,但生物测定表明其仍保持杀虫活性。对转Bt基因作物的研究表明,Bt棉组织埋入土壤7d内,土壤中可提取的杀虫晶体蛋白浓度快速下降,之后下降速度比较稳定,甚至维持数周不变。而Bt玉米根系分泌物和植株残体释放的杀虫晶体蛋白在土壤中至少保持180d杀虫活性。虽然关于Bt毒蛋白在土壤中存留时间的长短,可能因实验材料、试验方法和条件的不同而不同。但是总之,如果长期种植转Bt基因作物,很可能会造成Bt毒蛋白在土壤中的积累,并最终威胁到整个土壤生态系统的平衡。目前对土壤中Bt毒蛋白定性和定量检测的方法主要有印迹分析法(Western-blotting)、SDS-PAGE法、斑点印迹酶联免疫吸附法(dot-blotELISA)、流式细胞仪法(Flowcytometer,FCM)、ELISA平板试剂盒及试剂条和生物测定法。其中最直接、简易、准确的方法是ELISA平板试剂盒及试纸条快速检测法和生物测定法。但检测土壤残留Bt毒蛋白时,采用的方法不同,检测的结果也有差异。     

种植转Bt基因棉土壤中Bt蛋白的分布

采用盆栽试验结合酶联免疫法(ELISA)测定了转Bt基因抗虫棉及常规棉花不同生育期根际及非根际土壤中的Bt蛋白含量.结果表明:红壤、黄棕壤及黄褐土种植转Bt基因棉花后根际土中Bt蛋白含量显著高于非根际土,而种植常规棉花的根际土与非根际土中Bt蛋白含量差异不显著.在初蕾期转Bt基因棉根际土中的Bt蛋白含量为黄褐土＞黄棕壤＞红壤,分别为常规棉根际土的144%、121%和238%;而在盛花期为黄棕壤＞黄褐土＞红壤,分别为常规棉根际土的156%、116%和197%.无论种植转Bt基因棉还是常规棉,供试土壤的根际和非根际土中Bt蛋白含量都随棉花生育期的推进先增加后减少,在盛花期达最大值.整个生育期内,转Bt基因棉根际土中的Bt蛋白含量大于其非根际土;种植转Bt基因棉土壤中Bt蛋白含量高于常规棉,说明转Bt基因棉花的Bt蛋白可释放到根际土中.     

Bt抗、感种群亚洲玉米螟幼虫取食Bt玉米后Cry1Ab杀虫蛋白在其体内的组织分布与含量

采用ELISA方法检测了实验室汰选的对Cry1Ab产生107倍抗性的亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenée)种群与敏感种群3龄幼虫取食表达Cry1Ab杀虫蛋白的Bt玉米心叶后,杀虫蛋白在幼虫体内的分布情况。结果表明：Cry1Ab杀虫蛋白在抗性种群幼虫中的组织分布情况与敏感种群相近,主要存在于中肠组织和血淋巴中。抗、感种群中均以含有内含物的中肠组织中含量最高,分别为277.2 ng/g 和104.9 ng/g;其次为血淋巴,分别为93.7 ng/g 和69.5 ng/g;不含内含物的中肠组织中52.7 ng/g 和40.1 ng/g;在丝腺和马氏管组织的含量很低,丝腺中分别为8.5 ng/g和11.7ng/g,而马氏管中分别为6.7 ng/g和6.5 ng/g。脂肪体、生殖器官中未检测到杀虫蛋白。抗性种群中肠组织(含有内含物和不含内含物)中Cry1Ab的含量显著高于敏感种群。幼虫期取食过Bt玉米的亚洲玉米螟发育的蛹、成虫及其卵中均不含杀虫蛋白,说明Bt杀虫蛋白不会通过幼虫取食向蛹、成虫及卵传递。     

转Bt基因植物中外源基因时空动态表达的研究现状

在转Bt基因植株中 ,外源基因的时空动态表达对于害虫的防治和转基因安全评价管理具有重要意义。利用生物测定法和酶联免疫吸附测定法 (ELISA) ,对植物不同组织在同一发育阶段、同一组织在不同的发育阶段以及不同转基因植株的外源基因的时空动态表达进行研究。本文综述了转基因植物中外源基因时空动态表达的研究进展和现状。     

欧美杨108号转蜘蛛杀虫肽与Bt毒蛋白嵌合基因的研究

以欧美杨108号为外植体材料,利用农杆菌介导法成功地将抗虫基因（蜘蛛杀虫肽+Bt毒蛋白的嵌合基因）导入受体中。通过PCR检测,凝胶电泳结果显示8个卡那霉素抗性芽中,6个存在目的基因;经PCR-Southern印迹杂交检测,阳性率为50%,进一步表明目的基因成功整合到欧美杨108号基因组内。     

转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达行为

Bt toxin genes were the insecticidal genes most widely used in genetic engineering of pest resistant plant, were of important significance to study their expression behavior in transgenic plants. In this work, a plant expression vector, pBinMoBc, was constructed. It contained the Cry IA(c) gene under control of chimeric OM promoter and the Ω factor. The vector was transferred into tobacco (Nicotiana tabacum L.) plant via Agrobacterium-mediated transformation. ELISA assay showed that the expression levels of the Cry IA(c) gene in transgenic tobacco plants were significantly higher than that in wild-type tobacco plants. The highest could be up to 0.255% of total soluble proteins; the expression level of CryIA(c) gene in transgenic tobacco plant was changeable during the development stages of tobacco plant. Bioassay showed that pBinMoBc transgenic tobacco plants had more notable insecticidal activity than the wild-type tobacco plants. The above results indicated that pBinMoBc was an effective pest-resistent plant expression vector. This study would be very helpful in screening transgenic cotton with high resistance to cotton bollworm (Heliothis armigeva Hubner).     

外源抗虫蛋白与内源抗虫因子的交互作用

以次生代谢物质萜烯类、黄酮类以及单宁等为基础的自身化学抗虫性一直是植物化学防御的核心.随着基因重组技术的发展,许多作物获得了一种新的化学防御形式,即以表达外源基因产物来进行防御.外源抗虫蛋白与内源抗虫物质的协调性问题,在利用外源基因工程改良植物抗虫性时是非常重要的,同时也是转基因作物安全性和生态学评价的重要方面.转基因植物中外源与内源抗虫系统间的协调性的研究取得了一些成果,但尚未引起人们足够的重视.综述了离体条件下和在转基因植物体内,外源抗虫蛋白Bt和GNA等与植物次生代谢物质以及各抗虫蛋白之间交互作用的研究进展,并探讨了研究各抗虫因子交互作用的意义.     

转基因植物表达重组蛋白的研究进展

植物表达系统的一些潜在优点 ,如重组蛋白的高积累水平 ,糖基化 ,细胞内的定位和自然储藏的稳定性是目前植物生产重组蛋白系统研究成为热点的主要原因 .在研究和选择转基因植物表达系统的过程中 ,转化 ,转化后 ,翻译 ,翻译后等环节都会影响到最终产物的数量和质量 ,因此应该了解基因表达的规律 ,以制定植物生产重组蛋白合适的策略 ,重组蛋白积累水平是关键 ,但其它因素如植物的选择 ,转基因植物的处理 ,下游加工等同样重要 .某些情形下 ,仅下游加工的成本一项就影响到特定植物表达系统的实际应用价值 .     

Bt棉与常规棉根际土壤Bt毒蛋白和植物激素变化动态

通过ELISA法对常规棉（石远321）和转基因抗虫棉（99B、SGK321）根际土壤苏云金芽孢杆菌（Bt）毒蛋白和植物激素含量进行了分析,结果表明抗虫棉根际土壤Bt毒蛋白含量显著高于常规棉,特别是从苗期到盛花期抗虫棉根际土壤Bt毒蛋白含量高出常规棉200-300ng／g。抗虫棉根际土壤中脱落酸（ABA）和生长素吲哚乙酸（IAA）含量变化趋势与常规棉相比表现出较大差异。常规棉与抗虫棉根际土壤中ABA变化趋势表现为相似的单峰曲线,而抗虫棉根际土壤中ABA含量变化幅度明显小于常规棉。在棉花生长发育后期抗虫棉根际土壤中赤霉酸（GA3）含量较高,而常规棉根际土壤中GA,含量升高较抗虫棉早且变化幅度大,在高峰处常规棉高于抗虫棉,低谷时抗虫棉高于常规棉。7月17日常规棉根际土壤IAA含量显著高于抗虫棉,8月27日抗虫棉又大大高于常规棉,其他时期变化不大。上述结果表明,外源Bt基因的插入或表达能引起棉花根际土壤中Bt毒蛋白和植物激素含量的较大改变,这种改变可能会影响到抗虫棉的生长发育,并对环境产生影响。     

转双基因烟草对棉铃虫的杀虫活性评价

以含Ｂｔ杀虫蛋白基因（单基因）烟草和常规烟草为对照,系统测定了含Ｂｔ与豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白基因（双基因）的抗虫烟草对棉铃虫不同龄期幼虫的杀虫活性。结果表明：１￣３龄幼虫取食转双基因烟草３ｄ后死亡率为８０．５％￣９９．３％,取食６ｄ后死亡率达１００％,均显著高于转单基因烟草。２龄幼虫取食转基因烟草３ｄ后死亡率为８０．５％￣９９．３％,取食６ｄ后死亡率达１００％,均显著高于转单基因烟草。２龄幼虫取食     

Changes of Bt Toxin in the Rhizosphere of Transgenic Bt Cotton and its Influence on Soil Functional Bacteria

Summary The concentrations of Bacillus thuringensis (Bt) toxin released from root exudation of Bt cotton were measured by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and its impacts on the numbers of culturable functional bacteria in the rhizosphere were determined by cultivation. No Bt toxin was found in the rhizosphere of non-Bt cotton (SHIYUAN321), but varying levels of Bt toxin were present in the rhizosphere of two Bt cotton varieties (NuCOTN99^B and SGK321) during the entire growth period. The levels of Bt toxin in the rhizosphere of NuCOTN99^B were significantly higher (p<0.05) than those of SGK321 within all sampling dates except on June 17th in the whole growth season. Significant differences (p<0.05) were found in the numbers of the three functional bacteria between SHIYUAN321 and NuCOTN99^B within each sampling day from May 27th to October 27th. No significant differences were found in the numbers of functional bacteria among three cultivars after growth season. Fortification of pure Bt toxin into rhizospheric soil did not result in significant changes in the numbers of culturable functional bacteria, except the nitrogen-fixing bacteria when the concentration of Bt toxin was higher than 500 ng/g. The results indicated that Bt toxin was not the direct factor causing decrease of the numbers of bacteria in the rhizosphere, and other factors may be involved.     

转基因水稻表达的Bt蛋白对拟环纹豹蛛(Pardosa pseudoannulata)生长发育的影响

为明确转基因水稻表达的Bt蛋白沿捕食性食物链的传递及其对生态系统中较高营养级生物的影响,在实验条件下(28±0.5 ℃,R.H=80%,L∶D=12h∶12h)以田间优势自然天敌拟环纹豹蛛为对象,以取食转Cry1Ab/Cry1Ac基因水稻汕优63(简称Bt水稻)叶片24 h的稻纵卷叶螟幼虫为猎物饲养拟环纹豹蛛,并测定了...