甜菜夜蛾几丁质合成酶基因的克隆与表达模式

几丁质合成酶(CHS)是昆虫几丁质生物合成过程中至关重要的酶。但是,迄今有关昆虫CHS的研究工作仍不多见。中山大学昆虫学研究所张文庆教授和他的研究生从鳞翅目昆虫甜菜夜蛾Spodoptera exigua中克隆得到了A类CHS基因(SeCHSA),这是我国克隆获得的第1个昆虫CHS基因(DQ062153)。此     

中国家蚕抗菌肽ABP-CM4在E.coli中的融合表达及活性分析

参照天然抗菌肽CM4(ABP-CM4)氨基酸序列和大肠杆菌偏爱密码子,采用rPCR法获得CM4基因后重组到表达载体pET32a上,在E.coli中融合表达。表达产物以可溶性存在,经Ni2 -NTA琼脂糖亲和层析获得融合蛋白,再经甲酸切割、亲和层析和阳离子交换层析,得到纯化的重组抗菌肽。琼脂糖扩散法和液相测定法证明了纯化的抗菌肽具有抗菌活性。     

家蚕溶茧酶基因的真核表达及其产物的生物活性检测

为了研究家蚕 Bombyx mori 溶茧酶基因 （cocoonae）真核表达及其产物的生物活性,将溶茧酶基因（GenBank 登录号 EF428980）克隆至杆状病毒转移载体 pFastBac^TM 1 中获得 pFast-cocoonase,将其转化 DH10Bac 感受态细胞后,PCR 方法检测证实所分离的重组病毒 DNA 中含有目的片段溶茧酶基因。用脂质体法 转染家蚕 BmN 细胞,获得重组病毒。SDS-PAGE 分析显示,感染重组杆状病毒 Bac-cocoonase 的细胞表达产物在约为 27.6 kD 处出现特异性条带,这与预测的蛋白大小相符。用该表达产物与茧丝反应后,电镜下观察茧丝的形态,结果表明表达产物对茧丝的丝胶层有一定的水解作用。     

植酸酶基因在家蚕—杆状病毒表达系统中的表达及其酶学特性

将从黑曲霉菌株Aspergillusniger 96 3克隆并经改造后的植酸酶基因在昆虫 -杆状病毒表达系统中表达 ,SDS PAGE电泳检测蚕体和蛹的表达量分别达到 1.4 3g L血淋巴液和 1.90g L血淋巴液。酶活性测定结果表明 ,在蚕体和蛹的表达活性分别为 4 .6 7× 10 8u L血淋巴液和 5 .99× 10 8u L血淋巴液。该酶活性的最适温度范围为 5 0～6 0℃ ,最适pH值为 5 .5～ 5 .0和 2 .5。研究表明杆状病毒系统表达的植酸酶具有耐酸性和抗高温的特性 ,可以用于生产饲用植酸酶。     

Bac-to-Bac/BmNPV杆状病毒在家蚕幼虫中表达重组鲎C因子

鲎C因子是鲎血细胞中一种对内毒素具有高亲和力的丝氨酸蛋白酶,被内毒素激活后可水解人工合成的三肽底物,因而能替代传统的鲎试剂用于内毒素检测。通过RT-PCR从东方鲎血细胞中扩增出鲎C因子基因(factor C)序列,利用Bac-to-Bac/BmNPV杆状病毒表达系统在家蚕幼虫中表达该蛋白,并对其进行活性测定。结果显示:被感染的家蚕血清稀释后能检测到Factor C活性,稀释500倍的血清可以用于内毒素检测,且其灵敏度能达到0.2 EU/mL,有望开发新型的、低成本的内毒素检测试剂。     

家蚕Bms3a基因真核表达载体的构建及其在家蚕细胞和蚕体中的表达

Bms3a基因可能在家蚕Bombyx mori抗病或细胞凋亡中有一定的作用。将融合有绿色荧光蛋白的Bins3a基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中获得了pFastBac-IE1-Bms3a-EGFP真核表达载体,利用杆状病毒(Bac-to-Bac)表达系统筛选重组杆状病毒,以重组病毒感染家蚕BmN细胞和五龄幼虫,分别在感染24h和48h检测到有绿色荧光蛋白的表达,Western blot证明表达的融合蛋白在相对分子量约57kD处出现特异条带,与预计的蛋白理论值相符。结果表明BmS3A-EGFP融合蛋白在家蚕细胞BmN及幼虫体中得到高效表达。研究结果为进一步研究BmS3A蛋白的功能奠定了基础。     

家蚕抗菌肽-死亡素杂合肽基因在大肠杆菌中的克隆与表达

近年来的研究发现 ,抗菌蛋白在生物体非专一性防御系统有着重要的作用 ,已有数十种具有抗菌活性的多肽被分离 ,这些多肽可大致分为 3类 ,即含分子内二硫桥的抗菌肽 ;具有双亲α 螺旋结构的抗菌肽 ;以及富含某种氨基酸残基的抗菌肽[1 ] ,一般来说 ,这些抗菌肽具有分子量小 ,稳定性好 ,无细胞毒性 ,抗菌谱广等特点。多种抗菌肽的一级结构和二级结构已经确定[2 ] ,但作用机理仍不明了。一般认为可能存在两种作用模式 ,即 1)通过肽 脂膜相关作用杀菌 ;2 )通过受体介导的识别过程起作用[1 ] 。ＣｅｃｒｏｐｉｎＢ是一种较早从家蚕中分离得到 ,由 …     

不同区段HIV-1 env基因在Bac-to-Bac昆虫细胞杆状病毒表达系统中的表达及检测

利用昆虫细胞杆状病毒表达系统,将从一株HIV-1阳性克隆质粒中获得的几个HIV包膜蛋白基因片段,克隆入转移载体中得到重组病毒.用此重组病毒感染昆虫细胞后表达出3种HIV包膜蛋白,即GP120-41P、GP41T、GP41P,分别含有HIV-1包膜糖蛋白GP120及部分GP41,删除了N端12个疏水氨基酸的GP41和仅有主要表位约240个氨基酸的GP41.收获后分别以Western-blotting和EIA检测,有较好的免疫学活性,其中GP41T的活性最强.该实验为HIV包膜蛋白的结构研究提供了依据,加以改进后可能有免疫检测的价值.     

抗癌胚抗原单链抗体基因在家蚕细胞和幼虫中的表达

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因插入家蚕杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫＨｉｓ, 与修饰的家蚕核型多角体病毒ＢｍＢａｃＰＡＫＤＮＡ共转染家蚕细胞, 经同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的抗ＣＥＡＳｃＦｖ 基因的重组病毒ＢｍＢａｃＳｃＦｖ。用重组病毒分别感染家蚕细胞和幼虫, 在两者中均得到了高效表达, 产物分子量为２８ｋＤ, 前者占细胞总蛋白的６ ％ , 后者为０ ．３ ｍｇ／ 蚕。目的基因在家蚕细胞和幼虫中表达产物经Ｎｉ２＋ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ亲和柱纯化, 前者纯度可达９０％ 以上, 后者纯度较低; 纯化后的融合蛋白具有ＣＥＡ 结合活力, 其亲和常数分别为５ ．４×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 和２．３ ×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－１ , 略低于其亲本单抗Ｅ７Ｂ１０ ２．７ ×１０９／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 。     

甜菜夜蛾性信息素激活肽基因在雌成虫的不同发育时期的表达

利用Northern杂交方法,在转录水平上,对甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)性信息素激活肽(PBAN)基因在不同发育时期表达进行了研究。结果表明,PBAN基因在甜菜夜蛾不同发育时期的表达有差异。在2日龄的处女蛾的咽下神经节(SG)中,进入暗期第3时、第9时表达量较高,在光期表达量相对较低;在不同日龄的处女蛾SG中,进入暗期第5时以1日龄最高,2日龄次之,以后在每日龄的表达逐渐减弱。文中对这些现象进行了分析和讨论。     

ARTIFICIAL SYNTHESIS OF SWINE HEPCIDIN GENE AND EXPRESSION IN Pichia pastoris

In order to express swine hepcidin gene in Pichia pastoris, a DNA fragment coding hepcidin gene was synthesized with adaptation to yeast codon usage of highly expressed genes. A Kex2 signal cleavage site was fused in the 5′ end of the DNA fragment for getting a peptide with the same N-end as native hepcidin. The 96-bp DNA fragment was ligated into the expression plasmid of pGAPZaA to construct pGAPZaA-hepcidin vector, which was transferred into P. pastoris (X33) to express hepcidin gene for extracellular secretion of protein at 86 µg/mL. A band of 2.76 kD molecular mass was detected by Tricine sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) analysis. Through antibacterial assay, the expressed hepcidin displayed obvious antibacterial activity. The minimal inhibitory concentration (MIC) was 5.38 and 2.69 µg/mL for Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis prolification inhibitions, respectively.