胚胎干细胞向造血细胞分化研究

胚胎干（embryonic stem,ES）细胞是来源于囊胚的内细胞团（inner cell mass,ICM）,具有发育的全能性或多能性,能嵌合到早期胚胎,在体内可以参与各种组织发育甚至包括生殖细胞;在体外分化培养条件下,可以顺序分化出各种组织细胞,与体内完整胚胎发育过程相符合,而且可以通过调节ES细胞某些基因的表达而调节其分化。因此,ES细胞是研究哺乳动物早期胚胎发育、细胞分化及其关键基因鉴定的理想模型。另外,胚胎生殖脊（embryonic germ,EG）细胞系也具有同样的生物学特性,它是由早期胚胎的原始生殖脊（primordial germ,PG）细胞建株而来。最近研究显示：ES细胞在体外不但可以分化为所有造血细胞系,而且还可以分化为具有长期增殖能力的造血干细胞。作者就胚胎干细胞向造血细胞和造血干细胞分化及其诱导因子和调控基因的表达作一综述。     

诱导胚胎干细胞向神经细胞分化方法的研究与探讨

胚胎干细胞(ES细胞)是一种能够在体外进行不断自我更新,并具有多种分化潜能的细胞。胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的研究进展迅速,相关实验技术和理论也不断发展。总结了近年来各国研究者诱导小鼠和人胚胎干细胞向神经细胞分化的方法,分析了一些方法的原理并初步探讨其相关的分子机制,并提出一些可行性新方法。胚胎干细胞向神经细胞诱导分化因其体外的可操作性、来源的广泛性及质量可控性将有可能成为临床上治疗神经系统疾病的有效方法。     

溶血磷脂酸对离体培养的大鼠胚胎神经干细胞向神经胶质细胞分化的影响

本研究用免疫细胞化学荧光双标技术观察了溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid,LPA）对大鼠胚胎神经干细胞（neural stem cells,NSCs）分化为少突胶质细胞（galactocerebroside—positive,Gal-C阳性）和星形胶质细胞（grim fibrillary acidic protein-positive,GFAP阳性）的影响,并且用RT-PCR技术对NSCs可能表达的LPA受体进行分析。结果显示：（1）加入不同浓度（0．010．0μmol／L）LPA,第7天进行检测时,少突胶质细胞数量呈明显的剂量依赖性增加,峰值出现在1．0μmol／LLPA组,少突胶质细胞所占百分比从对照组的8．5％增加到32．6％;（2）星形胶质细胞的分化几乎不受LPA的影响,第7天时各LPA处理组星形胶质细胞百分比与对照组相比均无显著性差异;（3）RT-PCR结果显示,大鼠胚胎NSCs的LPA1和LPA3受体表达明显,而LPA3受体表达很弱。以上结果表明,较低浓度的LPA可能作为细胞外信号,通过LPA1和LPA3受体促进大鼠胚胎NSCs向少突胶质细胞分化和生成,但对星形胶质细胞的分化过程无明显影响。     

Wnt3a诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的研究

目的：研究Wnt3a在诱导小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化中的作用和原理。方法：设计不同浓度,不同成分的Wnt3a条件培养基对小鼠胚胎干细胞诱导分化,对分化细胞进行形态学鉴定,通过免疫细胞化学检测心肌肌钙蛋白-T（cTnT）的表达,通过RT．PCR检测肌球蛋白重链（ot．MHC）和肌球蛋白轻链（MLC．2v）的表达。结果：Wnt3a诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌样细胞,分化细胞具有自动收缩性,免疫细胞化学检测心肌肌钙蛋白．T（cTllT）表达阳性,RT．PCR检测肌球蛋白重链（d—MHC）和肌球蛋白轻链（MLC-2v）表达阳性。经典Wnt信号途径的抑制剂Frizzled一8／Fc,能够抑制Wnt3a的诱导分化作用。结论：Wnt3a通过经典Wnt信号途径诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化。     

雷帕霉素促进胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的 雷帕霉素是小分子mTOR抑制剂,可激活细胞自噬.本研究检测了雷帕霉素对胚胎干细胞(ES细胞)向心肌分化的影响.方法 采用拟胚体(embryoid body,EB)加抗坏血酸诱导ES细胞向心肌分化.悬浮诱导阶段添加自噬激动剂雷帕霉素或抑制剂羟氯喹,通过免疫印迹检测LC3蛋白剪切以监测细胞自噬水平,通过检测EB球的心...     

ISL1与PHF8相互作用促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

近年的研究发现,在心肌细胞分化过程中,转录因子可以与表观修饰蛋白质结合进行更为精细的转录调控.作为转录因子的胰岛素基因增强子结合蛋白1(islet1,ISL1),在心血管发育过程中发挥至关重要的作用.然而,ISL1是否能够与表观修饰蛋白质相互作用,从而发挥更为精细的调控作用,目前尚未明确.本室研究发现,ISL1在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中,能够与组蛋白去甲基化酶PHD指蛋白8(PHF8)相互作用从而促进分化.实时RT-PCR和Western印迹的方法检测显示,ES细胞向心肌细胞分化过程中ISL1和PHF8具有相似的表达谱.通过免疫共沉淀的方法检测分化过程中ISL1与PHF8的结合,通过染色质免疫沉淀的方法对二者在ISL1下游靶基因增强子区的结合水平进行检测,利用实时RT-PCR检测二者的相互结合对心肌细胞分化的影响.结果显示,ISL1能够与PHF8相互作用,共同结合在ISL1下游靶基因Mef2c和Myocd的增强子区,协同促进ES细胞向心肌细胞的分化.本研究证实,在心肌细胞分化过程中,ISL1存在与表观修饰蛋白质PHF8的相互作用,从而进一步促进心肌细胞的分化.     

黄芪水提取物促进小鼠胚胎干细胞向血管平滑肌细胞分化的实验研究

目的：研究黄芪水提取物（Astragalus radix extract, ARE）对小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ESCs）来源的血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells, VSMCs）分化的影响。方法：将ESCs直接接种到IV 型胶原包被的培养皿中建立VSMC 分化模型,向培养液中添加不同剂量ARE（对照组不添加ARE,ARE 低剂量组60 g/mL ARE, ARE 高剂量组（120 g/mL ARE）,将3 组细胞连续培养14 天。分别应用免疫荧光染色、实时定量PCR 及Western Blot 技术检测各组VSMC 分化标志物表达情况。应用胆碱能受体激动剂卡巴可刺激各组细胞检测收缩反应。应用实时定量PCR技术检测调控VSMC 分化的重要因子的变化。结果：与对照组相比,ARE 处理后VSMC 分化标志物表达显著增加,且呈剂量依赖性。ARE 处理可提高VSMCs 的收缩能力。此外,ARE处理后,转化生长因子（Transforming growth factor ）的表达显著增加。结论：黄芪水提取物可能通过激活TGF- 促进ESCs向VSMCs分化。     

胚胎和成体神经干细胞分化机制的研究

神经干细胞的分化调控一直是发育神经生物学的重要研究课题。综述了调节胚胎和成体神经干细胞分化的细胞内在因素和外部环境因素,初步探讨了胚胎和成体神经干细胞分化机制的差异。     

小鼠胚胎干细胞向脂肪细胞分化过程中PPARγ2基因的表达模式

将PPARγ2基因启动子和报告基因荧光素酶相连接克隆于特定载体构建成表达质粒,电穿孔转染小鼠ES细胞,筛选阳性克隆.诱导ES细胞向脂肪细胞分化,通过定量检测荧光素酶活性跟踪PPARγ2基因的表达情况,以此研究脂肪细胞分化过程中该基因的表达模式.结果显示PPARγ2基因在未分化的ES细胞和EB形成的前两天中不表达,从EB形成的第3天开始表达,直至脂肪细胞分化完成.该基因在已完成分化的脂肪细胞中的表达远强于在分化中的前脂肪细胞中的表达.首次报道了从小鼠ES细胞到脂肪细胞分化过程中PPARγ2基因的表达模式,支持了PPARγ2基因为脂肪组织特异性表达基因的已有报道,并为脂肪细胞分化机理研究提供了线索.     

小鼠胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究

小鼠胚胎干细胞(ESC)在体外可以分化为多种细胞类型,其中包括各阶段的生殖细胞,甚至精细胞和成熟卵母细胞。ESC向生殖细胞分化的效率受到包括生长因子、激素和体细胞等多种因素的影响,在体外形成的是雌性配子还是雄性配子与ESC是XX型还是XY型没有必然联系。简要综述了小鼠生殖细胞在体内外的分化发育、性别决定和增殖等,并总结和展望了ESC向生殖细胞分化研究面临的问题和应用前景。     

胚胎干细胞及诱导多能干细胞向心肌细胞分化和调控的研究进展

胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）具有自我更新、无限增殖和多向分化的特性,包括分化成心脏组织的多种类型细胞。经体细胞重编程产生的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS）也被证明有类似胚胎干细胞的特性。但这些多能干细胞向心肌细胞自发分化的效率非常低,因此,如何有效地诱导这些多能干细胞向心肌细胞的定向分化对深入认识心肌发生发育的关键调控机制和实现其在药物发现和再生医学,如心肌梗塞、心力衰竭的细胞治疗以及心肌组织工程中的应用均具有非常重要的意义。该文重点综述了近年来胚胎干细胞及诱导多能干细胞向心肌细胞分化和调控的研究进展,并探讨了这一研究领域亟待解决的关键问题和这些多能干细胞的应用前景。     

胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中能量代谢变化的研究

本文通过定向诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞,对分化过程中胚胎干细胞、心肌祖细胞和心肌细胞糖酵解能力和线粒体氧化磷酸化能力进行实时定量检测,旨在探索分化过程中细胞能量代谢表型的转换机制.用GSK3抑制剂CHIR99021和Wnt信号通路小分子抑制剂IWP2的方法定向分化人胚胎干细胞为心肌祖细胞和心肌细胞;细胞免疫荧光检测...     

小鼠胚胎神经干细胞的分离培养及其鉴定

且的探索小鼠胚胎神经干细胞的体外培养方法,并获取高纯度的神经干细胞,为神经干细胞的深入研究提供实验材料。方法无菌条件下分离E15天小鼠胚脑皮质,制成单细胞悬液,在bFGF和B27存在的培养基中培养扩增,通过免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向。结果培养的部分细胞在B27和bFGF存在的无血清培养基中可以在体外分裂增殖,同时表达神经干细胞特异性抗原nestin,并在撤出B27和bFGF的有血清培养基中向神经细胞和胶质细胞分化。结论小鼠胚脑皮质存在具有多向分化潜能的神经干细胞,这些细胞可以在体外稳定培养、传代并自然分化,为细胞替代治疗提供了理想的细胞来源。     

成熟软骨细胞促进小鼠胚胎干细胞向软骨分化

为诱导胚胎干细胞向软骨细胞分化,采用胚胎干细胞与成熟软骨细胞共培养的方法以提供软骨诱导微环境．小鼠胚胎干细胞经初步分化,形成类胚体后,从中分选出Flk-1阳性细胞,其与猪关节软骨细胞混合后,接种于可降解材料支架,并植入裸鼠皮下．4周后经组织学检查及Ⅱ型胶原抗体免疫荧光检查证实,细胞材料复合物形成软骨组织．经小鼠主要组织相容性抗原染色,证实其中部分软骨细胞源自于小鼠胚胎干细胞．本研究建立了胚胎干细胞定向诱导分化的新方法．     

人胚胎干细胞定向分化为神经前体细胞

采用单层贴壁分化的方法在无血清条件下诱导同源饲养层培养的人胚胎干细胞定向分化,得到了高比例的神经前体细胞(97.5±0.83)%(P<0.05)。这些神经前体细胞具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。在长期的传代培养中发现,随着培养时间的延长,nestin阳性的神经前体细胞比例下降,同时发育能力也发生了变化。在传代培养的早期,神经前体细胞发育为神经元的比例很高,几乎没有胶质细胞分化出来。随着培养时间的延长,胶质细胞的比例逐渐上升。这与体内神经系统的发育过程非常相似。进一步研究发现具有bHLH(basic helix-loop-helix)结构域的转录因子neurogenein2(Ngn2)和Olig2可能在这一变化中起重要作用。因此,人胚胎干细胞来源的神经前体细胞能够模拟体内神经发育的模式,为在体外研究人的神经发育和再生医学奠定了基础。     

小鼠胚胎干细胞定向血管内皮和造血细胞分化体系的建立

目的:建立小鼠胚胎干细胞体外定向分化为血管内皮细胞和造血细胞的体系,并验证诱导后2种细胞的表面分子特征。方法:以小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层,首先在无血清培养基StemPro中加入骨形态发生蛋白4(BMP4)、激活素A、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-Basic)和血管内皮细胞生长因子(VEGF),诱导小鼠胚胎干细胞系R1/E 4 d后形成拟胚体;再将拟胚体消化后与OP9-DL1基质细胞共孵育,分别用干细胞因子(SCF)、VEGF和SCF、FLt3、白细胞介素3(IL-3)诱导向内皮和造血2个方向分化,并以CD31、CD45、CD144、Kit、CD201作为表面标志,流式检测诱导后细胞的表面分子特征和诱导效率;诱导10 d后免疫组化染色,进行内皮细胞的形态学鉴定。结果:诱导分化10 d后,免疫组化染色观察到多个内皮管状结构,流式检测CD31^+的内皮细胞比例为1.35%±0.05%,进一步分析CD31^+CD144^+CD45^-群体,有3.0%±0.2%的细胞表型为Kit^+CD201^+,提示该部分细胞可能是处于分化上游的内皮干祖细胞;CD45^+的造血细胞比例为35.0%±0.5%,其中0.35%±0.05%的细胞表达Kit和CD201,提示该部分细胞可能是处于分化上游的造血干祖细胞。结论:本研究将胚胎干细胞诱导为内皮细胞和造血细胞,并且能诱导出具有内皮、造血干祖细胞分子特征的细胞,可作为理想的体外诱导分化体系。     

血管紧张素Ⅱ在胚胎干细胞向心肌细胞分化中的作用

为检测血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,AⅡ）对小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）向心肌细胞方向分化的作用,采用10-4 mol/L维生素C诱导小鼠R1胚胎干细胞分化为心肌细胞. Western印记检测胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞中表达血管紧张素Ⅱ1 型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1R).诱导分化期间用1 μmol/L AⅡ刺激胚胎干细胞,计数搏动拟胚体的比例;诱导分化第14 d用real-time RT-PCR 和Western 印记检测心肌标志物的表达确定其作用. 结果显示,与对照组相比,1 μmol/L AⅡ处理组可显著增加搏动拟胚体的比例,上调心肌标志物mRNA的表达. 预先用1 μmol/L洛沙坦处理1 h后可显著阻碍这种上调作用. 本实验结果表明,AⅡ通过AT1R可促进小鼠R1胚胎干细胞向心肌细胞分化.     

人胚胎干细胞向神经上皮祖细胞的诱导分化

人胚胎干细胞具有自我更新和多向分化潜能,是研究早期胚胎发育和细胞替代治疗的重要细胞来源.采用一种与小鼠成纤维细胞共培养的方法进行人胚胎干细胞的神经诱导,可产生高纯度的神经上皮祖细胞,其神经上皮特异性基因的表达有一定的时空性;诱导生成的神经上皮祖细胞具有增殖潜能并可分化为神经元和星型胶质细胞,是潜在的神经干细胞.人胚胎干细胞来源的神经上皮祖细胞为研究神经发育和神经诱导提供了新材料,也为神经系统疾病的细胞替代治疗提供了新的细胞来源.     

小鼠胚胎干细胞向脂肪细胞分化过程中PPARγ2基因的表达模式

将PPARγ2基因启动子和报告基因荧光素酶相连接克隆于特定载体构建成表达质粒 ,电穿孔转染小鼠ES细胞 ,筛选阳性克隆。诱导ES细胞向脂肪细胞分化 ,通过定量检测荧光素酶活性跟踪PPARγ2基因的表达情况 ,以此研究脂肪细胞分化过程中该基因的表达模式。结果显示PPARγ2基因在未分化的ES细胞和EB形成的前两天中不表达 ,从EB形成的第 3天开始表达 ,直至脂肪细胞分化完成。该基因在已完成分化的脂肪细胞中的表达远强于在分化中的前脂肪细胞中的表达。首次报道了从小鼠ES细胞到脂肪细胞分化过程中PPARγ2基因的表达模式 ,支持了PPARγ2基因为脂肪组织特异性表达基因的已有报道 ,并为脂肪细胞分化机理研究提供了线索。     

小鼠胚胎干细胞定向分化为神经干细胞过程中microRNA的变化

目的用生物芯片技术分析胚胎干细胞定向分化为神经干细胞过程中microRNA(miRNA)的表达变化,筛选调控的分化的miRNA,研究分化调控机制。方法胚胎干细胞在含LIF培养基中培养3d后,采用经典5步培养方法定向诱导向神经干细胞分化,采用nestin作为神经干细胞标记进行鉴定,送检胚胎干细胞及神经干细胞,提取总RNA以及小分子RNA,经荧光标记后与miRNA基因芯片杂交,获得胚胎干细胞诱导前后miRNA表达谱。结果1)胚胎干细胞在含LIF培养过程中保持未分化状态,Oct-4、碱性磷酸酶表达阳性;2)经典五步法诱导胚胎干细胞定向分化为神经干细胞,nestin阳性细胞为85%;3)通过基因微阵列分析,有90个miRNA的改变显著,其中68个表达上调,22个表达下调。结论miRNA可能对胚胎干细胞定向分化为神经干细胞过程起到关键作用。