细胞培养结合实时荧光RT-PCR法快速检测甲肝病毒滴度的研究

目的建立一种细胞培养与实时荧光RT-PCR相结合的快速检测甲肝病毒滴度的方法。方法根据甲肝病毒(HAV)L-A-1株5'端基因组序列,设计了2条基因特异性引物及一条探针,建立实时荧光RT-PCR法,结合细胞培养检测甲肝病毒滴度,并与ELISA检测法进行比较。结果实验中建立的方法能特异检测甲肝病毒,细胞培养8d检测病毒滴度为lg107.0CCID50/mL。同一样本重复检测3次,批内样本Ct值的变异系数最大为0.89%,批间样本Ct值变异系数最大为1.66%。建立的细胞培养结合实时荧光RT-PCR法(细胞培养8 d)与细胞培养ELISA法(细胞培养28 d)检测甲肝病毒滴度结果差异无统计学意义(P0.05)。结论该方法具有快速、灵敏、特异等优点,应用于疫苗常规检测有良好前景。     

链特异性RT-PCR方法检测口蹄疫病毒负链RNA

旨在建立一种快速、灵敏、特异的检测口蹄疫病毒在复制过程中产生的负链RNA的方法。根据口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)病毒5’-非编码区(5’-UTR)基因序列,设计了5条引物链特异性RT-PCR引物,建立检测口蹄疫病毒负链RNA的链特异性RT-PCR方法。提取FMD病毒RNA,应用设计的正向引物T1-H1做反转录引物,经反转录和RNA酶A消化后,再经两轮链特异性PCR扩增,可特异性地检测FMDV在复制过程中产生的负链RNA。所建立的检测口蹄疫病毒负链RNA的链特异性RT-PCR方法是一种可靠的方法,在确定细胞培养物和动物感染FMDV的病毒复制和了解病毒的致病性研究中具有应用前景。     

RT-PCR一步法检测甲型肝炎活病毒方法的建立

建立灵敏、特异、快速检测甲型肝炎活病毒(HAV)的方法。提取HAV总RNA,选用HAV高保守区为目标区,设计合成一对引物,通过RT-PCR反应扩增其核酸,用琼脂糖凝胶电泳法检测其扩增产物,紫外灯下观察,约200bp处为目标片段,根据观察结果,计算HAV滴度。RT-PCR一步法快速、灵敏、重复性好、特异性强,可用于甲型肝炎活病毒检测。     

非洲马瘟病毒群特异性RT-PCR检测方法的研究

非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)为双股RNA病毒,感染所有马科动物.设计2对位于AHSV基因组S7片段的引物,经RT-PCR扩增,证实2对引物对6种血清型的AHSV RNA均有特异性扩增,且能对同属的蓝舌病病毒(BTV)、鹿出血热病毒(EHDV)进行区别诊断.经序列测定及Blast,证实所扩增的条带确为AHSV S7相应位置核苷酸序列,表明已初步建立AHSV群特异性RT-PCR检测方法.     

精制甲型肝炎灭活疫苗的狨猴保护实验

目的　检测精制甲型肝炎 (甲肝 )灭活疫苗的保护效果。方法　甲型肝炎病毒 (YN5株 )经Vero细胞培养制成精制甲肝灭活疫苗 ,采用普通狨猴进行疫苗的免疫原性和保护性研究。结果　 7只狨猴均有特异性抗体产生 ,无血清酶活性升高和肝组织学病理改变 ,接种疫苗的狨猴能抵抗甲肝病毒强毒 (Han ZD)株的攻击。但是 ,对照组狨猴均出现血清酶异常升高和肝组织学病理改变。结论　甲肝灭活疫苗 (YN5株 )具有良好的免疫原性和保护效果。     

甲肝病毒减毒株(H2)RNA的全长RT-PCR扩增

通过RT-PCR技术扩增了甲肝病毒减毒株(H₂)全长RNA,并对长片段RT-PCR扩增进行了方法学上的探讨.采用抗血清特异沉淀病毒;盐酸胍-酸性酚、氯仿一步法分离纯化病毒RNA,可得到高质量的RNA样品;以此RNA为模板,在无RNA酶的逆转录酶作用下,合成单链cDNA;继续以此cDNA为模板,利用32 mer寡核苷酸引物, 在Taq和Deep Vent DNA多聚酶的作用下进行PCR扩增,得到7.4 kb的扩增产物.     

巢式荧光定量RT-PCR检测中枢神经系统HCV方法的构建

目的 建立丙型肝炎病毒5′NCR基因的巢式荧光定量RT-PCR检测方法 ,用于中枢神经系统感染超低浓度HCV的准确和快速定量检测.方法 选择高度保守区5′NCR基因片段,设计并合成相应的特异性引物和探针,建立巢式荧光定量RT-PCR检测中枢神经系统感染样本中的超低浓度HCV正负链RNA的方法 .并对32例血清HCV抗体检查阴性的病毒性脑炎患者脑脊液有核细胞和外周血单个核细胞(PBMC)进行检测.结果 可特异性地检出脑脊液有核细胞及PBMC中HCV正负链RNA,最低检出浓度均可达7.85 copies/μl,与其他单股正链RNA病毒如登革热病毒(DEV)无交叉反应.32例血清HCV抗体检查阴性样本脑脊液有核细胞和PBMC中 HCV 5′NCR正链片段阳性的分别为1例(1/32)和2例(2/32),负链片段阳性的分别为1例(1/32)和0例(0/32).结论 本方法 的构建适用于中枢神经系统感染超低浓度HCV正负链RNA检测,且快速有效、敏感性和特异性较高,不易出现假阳性,可有效提高检出率,进一步完善目前临床常规检测HCV的方法 .     

SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测埃博拉病毒方法的建立

为了建立一种快速准确的检测埃博拉病毒(EBOV)亚型的方法。本研究根据GenBank中公布的EBOV NP基因序列,通过设计引物和优化反应条件,建立了一种SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法检测EBOV。以体外转录的EBOV RNA为模板进行试验,该方法检测的灵敏度可以达到1.0×102个拷贝/μL,检测范围达到9个数量级为102～1010,可检测5种亚型EBOV。建立的方法对马尔堡病毒(MARV)、登革病毒(DENV)、新疆出血热病毒(XHFV)、乙型脑炎病毒(JEV)、流感病毒(H1N1和H3N2)和猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)E基因组RNA无非特异性扩增。本文将荧光定量RT-PCR技术用于埃博拉病毒的定量检测中,并且建立了EBOV SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法。     

北美洲流行汉坦病毒多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立牛轭湖病毒(Bayou virus,BAYV)、纽约病毒(New York virus,NYV)、厄尼诺洛峡谷病毒(El Moro Canyon virus,ELMCV)以及岛景病毒(Isla Vista virus,ISLAV)四种病毒快速筛查、诊断的核酸检测技术,本研究选用上述四种病毒的N蛋白基因作为靶标区域设计四组特异性引物探针,建立四重实时荧光定量RT-PCR检测方法。用四种病毒体外转录RNA进行灵敏度和重复性验证,并使用其他病毒细胞培养物及体外转录RNA进行特异性验证。结果显示,四重实时荧光定量PCR扩增效率均可达到95%以上,四种病毒体外转录RNA灵敏度介于1～10拷贝/μL,与单重检测方法无明显差异,且与其他病毒无交叉反应。稳定性评价结果显示,批内、批间变异系数均在3%以内。本研究所建立的检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于相关样本的诊断与筛查。     

GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用

利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,建立一种多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,同时检测引起手足口病的9种常见的人肠道病毒—人肠道病毒71型(HEV71)、柯萨奇病毒A组(CVA)16、4、5、9、10型和柯萨奇病毒B组(CVB)1、3、5型。优化多重反应体系中针对5’UTR区的肠道病毒通用引物和11对针对9种血清型人肠道病毒VP1区的特异性引物的浓度比例,分别以病毒细胞培养物和阳性粪便标本来验证多重反应体系的特异性,以TCID50定量的细胞培养物和克隆质粒体外转录的RNA梯度稀释液来检测多重检测体系的灵敏度。结果表明,优化后的多重检测体系,可扩增出人肠道病毒共有的保守片段的和型特异性片段,HEV71和CVA16细胞培养物的检测下限为100.5TCID50/μL,并可在103copies/μL水平同时、特异地检测出9种病毒RNA。该方法灵敏度高、特异性强,可快速对大量临床样本进行高通量检测,用于手足口病的分子流行病学调查。