体外重构STUB1介导α-1抗胰蛋白酶突变体Z蛋白泛素化修饰反应体系

α-1抗胰蛋白酶Z型突变体蛋白(α-1 antitrypsin Z-mutant protein, ATZ)是引发α-1抗胰蛋白酶缺陷症(α-1 antitrypsin deficiency, AATD)的主要原因,研究ATZ蛋白的泛素化修饰和降解对于治疗AATD具有重要意义。STUB1是一种重要的E3泛素连接酶,参与调节多种蛋白质的泛素化修饰。然而,STUB1是否参与ATZ的泛素化修饰尚未明确。本研究首先将ATZ和STUB1的编码基因克隆到pET28a质粒,构建了这2个蛋白的表达质粒。随后,将重组质粒转入大肠杆菌表达系统,在优化诱导条件实现了重组蛋白的异源表达。通过金属螯合亲和层析技术纯化得到目的蛋白,并通过蛋白质谱分析验证了其氨基酸序列的准确性。利用纯化的ATZ和STUB1重组蛋白,构建了一个体外泛素化修饰反应体系。实验结果显示,在ATP、E1泛素激活酶和E2泛素结合酶的协同作用下,STUB1成功催化了ATZ的泛素化修饰。本研究提供了一种体外获得Z型突变体ATZ纯化蛋白的方法,并确认了STUB1介导ATZ的泛素化修饰功能,推进了对α-1抗胰蛋白酶Z型突变体蛋白在细胞内降解过程的调控机制的理解。     

α_1-抗胰蛋白酶的分离纯化及应用研究进展

α_1-抗胰蛋白酶为人血浆中微量蛋白,其浓缩制剂在临床上具有治疗肺气肿等疾病的确切疗效．综述了近来α_1-抗胰蛋白酶分离纯化工艺和应用研究的进展,结合生化分离纯化技术的发展,讨论了该产品制备新工艺的开发方向．     

α1-抗胰蛋白酶的研究进展

自1963年首次报道α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)缺失与肺气肿的关系以来,α1-AT的结构和功能、作用原理等得到进一步的认识。伴随α1-AT产品的不断研制,对其临床应用及其临床研究更加广泛深入,对此进行综述。     

鳜鱼CRP cDNA和斜带石斑鱼AAT cDNA的克隆与序列分析

采用RT-PCR及RACE法分别克隆得到鳜鱼(Siniperca chuatsi)C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)cDNA全序列和斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,AAT)cDNA全序列.鳜鱼CRP基因cDNA全长为914 bp,其中5'非翻译区(5'-UTR)为49 bp,3'非翻译区(3'-UTR)为199 bp,开放阅读框(ORF)为666 bp,编码222个氨基酸.序列同源性分析发现,推测的鳜鱼CRP氨基酸序列与小鼠(Mus musculus)、人类(Homo sapiens)、大鼠(Rattus,norvegicus)、非洲蟾蜍(Xenopus tropicalis)和中国鲎(Tachypleus tridentatus)的CRP氨基酸同源性分别为33.2%、32.4%、31.5%、24.9%和22.4%.斜带石斑鱼肝脏ATT基因cDNA全序列长1 785 bp,其中,5'-UTR为13 bp,3'-UTR为530 bp,ORF为1 242 bp,编码414个氨基酸.序列同源性分析发现,推测的斜带石斑鱼AAT氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)、非洲爪蟾(X.laevis)、楔齿蜥(Sphenodon punctatus)、大鼠、人类、狒狒(Papio papio)和小鼠的AAT氨基酸序列同源性分别为59.2%、40%、38.6%、38.5%、37.7%、37%和36%.鳜鱼CRP基因和斜带石斑鱼AAT基因cDNA全序列的获得为其疾病相关分子机理研究奠定了基础,对今后进一步进行种苗育苗的研发,并以此为依据提高其人工育苗仔鱼成活率有重要意义.     

草鱼α1-抗胰蛋白酶基因cDNA全长克隆与表达分析

采用RACE技术获得α1-抗胰蛋白酶基因cDNA全长序列为1 469 bp,开放阅读框为1 329 bp,可编码442个氨基酸。5′非编码区长19 bp,3′非编码区长121 bp。核苷酸序列分析表明,在N端可能存在一个由1～21位氨基酸残基组成的信号肽;与斑马鱼的同源性最好,其次是虹鳟;在系统进化上,与在斑马鱼、虹鳟共聚为一个大支。用半定量RT-PCR分析正常及细菌诱导下草鱼α1-抗胰蛋白酶基因在不同组织中的表达分布。结果显示:正常情况下,草鱼α1-抗胰蛋白酶在肝脏表达最丰富,在脾脏、前肾、前肠、中肠、后肠和也有少量表达;细菌诱导下,肝脏中表达最强,前肾、脾脏、肠道中表达均明显提高,心脏和后肾中也出现较高表达。提示α1-抗胰蛋白酶可能参与了机体对嗜水气单胞菌感染的免疫应答。     

α1-抗胰蛋白酶的分离纯化

为建立从Cohn's组分IV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)的技术路线,以Cohn's组分IV为原料,利用还原剂1,4-二硫苏糖醇(DTT)、气相二氧化硅等处理,再经压滤、离子交换层析和疏水层析提取α1-AT.用SDS-PAGE及合成基质法检测α1-AT的纯度以及生物活性.结果可见,Cohn组分IV沉淀中α1-AT占蛋白总量的11%～13%,经该工艺提取的α1-抗胰蛋白酶纯度为97.6%,疏水层析后α1-AT的收获率为21%,比活为每毫克总蛋白中含 0.54 mg功能活性α1-AT.可见用此方法从Cohn组分IV沉淀中可制备高纯度的α1-AT.     

西藏地区藏族群体α1-抗胰蛋白酶的遗传多态性及一种新的Pi变异型

作者用超薄层聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦技术,调查了204名西茂地区无血缘关系藏族个体血清α1-抗胰蛋白酶（Pi）的表型,除检出6种常见PiM亚型外,还检出了4种变异型。其中,1种是国内外尚未见报道的新的Pi变异型,1种是缺陷型,其血清Pi相对含量为69.51%。推算出Pi等位基因频率为：PiM1=0.7624,PIM2=0.1634,PiM3=0.0668和PiV=0.0074。 The distribution of subtypes and gene frequencies ofα1-antitrypsin were studied in 204 unrelated healthy blood donors in Tibetan population in Tibet using ULPAGIF.Besides six common PiM subtypes,four kinds of Pi variants were detected.They were as follows:PiM1/L,R,M1-and a new variant.The relative concentration of M1-was 69.51%.The gene frequencies of Pi alleles were PiM1=0.7624,PiM2=0.1634,PiM3= 0.0668,PiV=0.0074.     

α1-抗胰蛋白酶——一种可抵抗SARS-CoV-2细胞侵袭的多功能蛋白的研究进展

α1-抗胰蛋白酶(α1AT)是一种由肝脏合成并分泌至外周血循环系统的多功能糖蛋白,其主要功能是中和肺部组织蛋白酶从而保障肺部不受自体蛋白酶的攻击而引发病变;此外在保持免疫平衡、控制炎症反应、抵御抗原侵袭等方面α1AT也发挥重要作用。近年来的研究发现α1AT具有良好的抗病毒功能,在抵抗包括HIV、SARS等在内的高致病病毒时, α1AT作为机体自身的天然防御分子发挥了很好的屏障作用。最新的研究显示, α1AT通过抑制受体细胞表面跨膜丝氨酸蛋白酶2的活性来降低SARS-CoV-2病毒颗粒与宿主细胞的结合作用,从而抑制SARS-CoV-2对细胞的侵袭。因此, α1AT作为极具潜力的天然蛋白质药物被用于应对新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的临床研究和治疗当中。该文从介绍α1AT天然生理学功能入手,展开介绍其抗病毒功能,着重归纳其在抵抗SARS-CoV-2细胞侵袭方面的机理研究进展。     

头孢他啶联合氨茶碱治疗慢性阻塞性肺气肿的疗效及对血清IGF-1、α1-AT、PDGF-B水平的影响

目的:探讨头孢他啶联合氨茶碱治疗慢性阻塞性肺气肿(COPD)的临床疗效及对患者血清胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、血清α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、血小板衍生生长因子-B(PDGF-B)水平的影响。方法:选择我院2015年4月至2018年4月收治的154例慢性阻塞性肺气肿作为研究对象,采用随机数字表法将其分为观察组与对照组。对照组采用头孢他啶治疗,观察组在对照组基础上加用氨茶碱联合治疗。对比两组患者的临床疗效、治疗前后血清IGF-1、α1-AT、PDGF-B水平的变化及不良反应的发生情况。结果:治疗后,观察组与对照组临床疗效总有效率分别为94.80%和71.43%,观察组显著高于对照组(P0.05);观察组血清IGF-1、PDGF-B水平均显著低于对照组[(110.67±13.58) vs.(143.17±15.74)ng/ml、(128.67±15.33) vs.(247.69±30.17)ng/L],而血清α1-AT水平明显高于对照组[(2.79±0.43) vs.(1.77±0.46)g/L](P0.05);观察组与对照组不良反应率分别为5.19%和50.64%,观察组明显低于对照组(P0.05)。结论:综上所述,头孢他啶联合氨茶碱治疗COPD的临床疗效和安全性均显著优于单用头孢他啶治疗,可能与其有效降低COPD患者血清PDGF-B、IGF-1,明显提高血清α1-AT水平有关。     

ox-AAT、HMGB1、MMP-9在胎膜早破孕妇中的表达及意义

目的:探讨氧化型α1-抗胰蛋白酶(ox-AAT)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在胎膜早破(PROM)孕妇中的表达及意义,为胎膜早破孕妇的早期诊断和治疗提供参考依据。方法:收集我院2016年1月到2017年1月收治的76例足月胎膜早破(TPROM)、44例未足月胎膜早破(PPROM)及50例正常足月孕妇作为研究对象,采用ELISA法检测母血及新生儿脐血ox-AAT、HMGB1、MMP-9水平,采用免疫组化法检测胎膜组织中ox-AAT、HMGB1、MMP-9蛋白的表达,比较三组母血、新生儿脐血及胎膜组织中ox-AAT、HMGB1、MMP-9水平,分析胎膜组织中ox-AAT、HMGB1、MMP-9之间相关性。结果:TPROM组与PPROM组母血、新生儿脐血、胎膜组织中ox-AAT、HMGB1、MMP-9水平均显著高于对照组(P0.05),且PPROM组以上指标均显著高于TPROM组(P0.05)。胎膜组织中MMP-9的表达与ox-AAT呈正相关(r=0.779,P0.05),与HMGB1的表达呈正相关(r=0.811,P0.05)。结论:母血、新生儿脐血、胎膜组织中ox-AAT、HMGB1、MMP-9变化与PROM及早产的发生相关,胎膜组织中MMP-9、ox-AAT、HMGB1均可能作为临床胎膜早破诊断以及治疗效果评价的参考指标。抗胰蛋白酶     

猪血浆α1-抗胰蛋白酶的分离纯化

α_1-抗胰蛋白酶(α_1-Antitrypsin,简称α_1-AT)是由肝细胞分泌的一种糖蛋白,是存在于动物血液中的一种重要的蛋白酶抑制剂,它能抑制多种丝氨酸类蛋白水解酶,占血浆胰蛋白酶抑制总活力的90％以上。α_1-AT通过调节蛋白水解酶的活性而参与机体的一系列生理活动,如血液凝固、纤维蛋白溶解、组织激肽释放、细胞融合、大分子装配和免疫反应等过程,对防止组织过度损伤有重要作用。目前国际上对人的α_1-AT研究较多,而对猪α_1-AT的研究甚少,仅见     

慢性阻塞性肺疾病患者血清NE、α1-AT、CRP、PCT的表达及与肺功能的关系研究

目的:探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者血清中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、C-反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)的表达水平及其与肺功能的相关性。方法:选取2013年3月-2015年6月河北北方学院附属第一医院呼吸内科收治的COPD患者87例作为研究对象,其中急性加重期(急性组)患者49例,稳定期(稳定组)患者38例,另选取同时期在本院进行健康体检的志愿者30例为对照组,检测并对比急性组、稳定组和对照组受试者的血清NE、α1-AT、CRP、PCT水平及肺功能指标,并分析COPD患者NE、α1-AT、CRP、PCT水平与肺功能的相关性。结果:与对照组对比,急性组与稳定组患者的NE、CRP、PCT水平均明显升高,α1-AT水平明显降低(P0.05),且急性组患者的NE、CRP、PCT水平高于稳定组,α1-AT水平低于稳定组(P0.05);急性组与稳定组患者的第1秒用力呼气容积占预计值的百分比(FEV1%)、第1秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV1/FVC)均低于对照组,且急性组FEV1%、FEV1/FVC低于稳定组(P0.05);经Spearman相关性分析显示,NE、CRP、PCT与FEV1%及FEV1/FVC均呈负相关,α1-AT与FEV1%及FEV1/FVC呈正相关(P0.05)。结论:COPD患者血清NE、CRP、PCT表达水平均明显升高,α1-AT表达水平明显降低,且NE、α1-AT、CRP、PCT均与肺功能存在一定相关性,加强对此类指标的监测有助于对COPD患者病情判断及治疗指导。     

从转基因羊奶获利

德国医药公司(Bayer AG)为购得转基因绵羊奶的专有权支付了1000万英磅。这种羊是由在爱丁堡的英国公司Pharmaceutical Proteins Ltd.(PPL)提供的。这种转基因羊的奶中表达了一种人型蛋白,即α-1-抗胰蛋白酶(AAT)。AAT在体内的功能与参与组织更新过程中蛋白质降解作用的弹性蛋白酶主要抑制剂的作用相似。AAT缺乏症是欧洲和北美地区最常见的人类基因失调病,患者达10多万人。AAT缺陷可引起肺部纤维化,并最终导致肺气肿。目前,可供AAT缺乏症患者使用的是从人血浆中提纯的AAT。因每位病人每月需用10g以上AAT,故AAT供不应求。此药昂贵,单价约110美元1克。     

纯化试验设备完成 明年临床试验在动物工场制造的医药

英国PPL Therapeutics公司最近完成纯化动物工场生产蛋白的试验设备,已进引用重组山羊生产人α1抗胰蛋白酶(AAT)的试验。英公司表示与德国Bayer公司合作于96年下半年在EU着手作为囊胞性纤维化治疗药的AAT的临床试验。     

干扰素-α1b单用及联合胸腺肽α1治疗慢性乙型肝炎疗效观察

我院自1997年初开始使用胸腺肽α1(Tα1)联合干扰素-α1b(IFN-α1 b)治疗慢性乙型肝炎(CHB)患者,取得满意疗效,现报告如下.     

上海地区胃癌病人运铁蛋白(Tf)、组特异性成分(Gc)、α_1-抗胰蛋白酶(α_1-AT)亚型分布的研究

用薄层聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳分析了上海地区202例汉族胃癌病人及202例正常对照组的运铁聋白(Tf)和α_1-抗胰蛋白酶(α_1-AT)亚型的分布,发现胃癌组Tfc_1c_1纯合子频率(0.3713)和Tfc_1基因频率(0.5718)显著低于对照组(分别为0.5149和0.6782),均为p<0.01,胃癌组Tfc_2c_2纯合子频率(0.2228)和Tfc_2基因频率(0.4019)显著高于对照组(分别为0.1436,p<0.05和0.2970,p<0.01),胃癌组和对照组的α_1-抗胰蛋白酶亚型分布无显著差异。用薄层聚丙烯酰胺等电聚焦结合免疫固定分析了上海地区200例汉族胃癌病人和200例正常对照组的组特异性成分(Gc)亚型分布,发现胃癌组Go1F表型频率(0.22)和Gc1F基因频率(0.4375)均显著高于正常对照组(分别为0.14和0.3600,均为p<0.05)。     

刀豆球蛋白A亲和双向免疫电泳对人体α_1-抗胰蛋白酶分子变异体的研究

α_1-抗胰蛋白酶(AAT)是一种低分子量的血清糖蛋白,属于丝氨酸蛋白酶类的蛋白酶抑制剂。由于某些AAT遗传的分子变异体与肺退行性疾病、肝硬化、肝癌及其它炎症性疾病有关,因而受到人们的重视。现已发现AAT含有40多个等位基因,因而所表达的基因产物往往是抗原性一致而分子构型不同的各种蛋白质分子。Fagerhol等曾用酸性淀粉凝胶电     

低氧诱导因子-1α与自身免疫性疾病的相关研究

自身免疫性疾病是由免疫应答异常引起的一系列复杂多变的疾病。研究表明,炎症和缺氧相互依存,持续的炎症和免疫反应增加了氧的消耗,从而导致局部组织缺氧,其中低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)已被证明在自身免疫性疾病中具有重要作用。HIF-1α是血管生成和免疫系统的调节因子,其介导的代谢转变和纤维化也在一些自身免疫性疾病中起关键作用。现就HIF-1α免疫功能及其在自身免疫性疾病中的作用,包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎性肠病、1型糖尿病和银屑病(psoriasis)等作一概述。     

缺氧诱导因子-1α和葡萄糖转运蛋白-1在不同月龄大鼠椎间盘中的表达

目的检测缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)和葡萄糖转运蛋白-1(glucose transporter-1,GLUT-1)在不同月龄大鼠椎间盘纤维环组织中的表达及其相关性,探讨HIF-1α及GLUT-1在椎间盘退变过程中的作用。方法取Wistar大鼠50只,分别以1,3,6,12,18个月龄分为5组。采用免疫组化法及Western blot法检测各组椎间盘中HIF-1α和GLUT-1表达情况。结果随着大鼠月龄的增长,其椎间盘纤维环组织中HIF-1α和GLUT-1的表达也发生变化,由低月龄组(1-3月龄)至成年组(6-12月龄)HIF-1α和GLUT-1表达逐渐减少,而老年组(18月龄)二者表达显著增加。且这种变化有显著统计学意义(P0.01)。纤维环中HIF-1α和GLUT-1的蛋白表达呈正相关。结论HIF-1α、GLUT-1表达水平的变化与椎间盘退变的发生关系密切相关,HIF-1α可以通过上调GLUT-1等相关因子并延缓椎间盘退变,可能作为椎间盘退变治疗研究的切入点。     

电针干预高血脂合并脑缺血大鼠TNF-α、IL-1β含量的影响

目的:本试验以高血脂合并脑缺血大鼠为研究对象,观察电针对高血脂合并脑缺血大鼠的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)的影响,探讨针刺早期干预高血脂症在脑血管病中的重要作用,为临床预防高质血症减少脑卒中的发生提供实验室依据。方法:采用FeCl3化学诱导大脑中动脉血栓闭塞模型法,将高脂血症大鼠造成高血脂合并脑缺血模型,电针术前干预及脑缺血后全程治疗,通过双抗夹心ELISA法,测定脑匀浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)的含量。结果:与高血脂合并脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血模型早期电针治疗组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)的下降均有显着性差异(P＜0．01,P＜0．05);高血脂合并脑缺血模型晚期电针治疗组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)下降均有显著性差异(P＜0．01,P＜0．05)。与高血脂合并脑缺血模型晚期电针治疗组比较,高血脂合并脑缺血模型早期电针治疗组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的下降有显著性差异(P＜0．05);白细胞介素-1β(IL-1β)没有统计学意义(P＞0．05),但值有下降。结论:电针治疗对高血脂合并脑缺血损伤大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)的过度表达产生抑制作用,减轻脑缺血损伤后炎症反应,尤其早期治疗组明显优于晚期治疗组。