中华鳖Dmrt1基因在雄性性别分化中的功能分析

在大部分脊椎动物中,Dmrt1基因在雄性性别决定和性腺分化中起重要的调控作用.本文通过慢病毒-Dmrt1-sh RNA干扰和Dmrt1-OE过表达载体系统的构建,成功实现了Dmrt1基因在中华鳖胚胎发育过程中的高效异常表达,以探讨Dmrt1在中华鳖雄性性别分化中的功能.结果显示,经过Dmrt1-sh RNA干扰处理后的ZZ胚胎,32.0%发育成雌性(生理)个体,而经过Dmrt1-OE过表达处理后,25.5%的ZW胚胎发育成雄性(生理)个体.苏木素/伊红(HE)染色、q PCR和免疫组化分析表明,Dmrt1基因敲低后,ZZ胚胎性腺外形和组织结构明显雌性化,雄性特异性基因Amh和Sox9表达显著降低,雌性特异性基因Cyp19a1和Foxl2表达则显著上升,出现雄向雌的性逆转现象;而Dmrt1过表达后的ZW胚胎性腺则向睾丸分化,Amh和Sox9表达急剧上调,Cyp19a1和Foxl2表达显著下降,呈现雌转雄性逆转现象.上述研究表明,Dmrt1基因在中华鳖早期雄性性别形成过程中是必需的,且它的异位表达能够单独启动雄性分化,是中华鳖雄性性别分化的关键因子.     

Sox8基因过表达诱导中华鳖ZW性腺的雄性分化

为了研究Sox8基因在中华鳖性别分化中的功能,研究利用慢病毒介导的过表达载体,在性别分化前的雌性中华鳖中过表达Sox8。通过组织学分析和生殖细胞标记蛋白VASA的免疫荧光染色发现在Sox8过表达后,50%的ZW性腺髓质区发育出睾丸特有的、含有生殖细胞的性索结构; qRT-PCR和免疫荧光结果显示雌性特异性基因Foxl2和Cyp19a1表达量显著降低,而调控睾丸发育的Dmrt1、Sox9和Amh基因表达上调。实验结果表明Sox8的过表达诱导ZW胚胎性腺往雄性方向分化,揭示了Sox8在中华鳖睾丸分化过程中的作用。     

中华鳖Dmrt1基因的克隆、表达及在性逆转中的变化分析

在大部分脊椎动物中,Dmrt1基因在雄性性别决定和性腺分化中起重要的调控作用.本文从m RNA和蛋白水平分析Dmrt1基因的组织差异性表达、在不同发育阶段性腺中的细胞定位及在性逆转中的表达变化,研究Dmrt1基因在中华鳖性别分化中的调控作用.Rapid-amplification of c DNA ends(RACE)结果显示,Dmrt1基因c DNA序列全长2409 bp,其中5′非编码区为230 bp,3′非编码区为1072 bp,开放阅读框为1107 bp,编码368个氨基酸,具有一个高度保守的DM结构域.荧光定量PCR和免疫组化结果显示,Dmrt1在性腺分化之前的第16期雄性性腺中开始表达,先于Amh和Sox9基因表达.随着性腺的发育,Dmrt1蛋白主要定位于性腺Sertoli细胞的细胞核上,在雌性性腺发育过程中并未见其表达.此外,在雌二醇诱导的雄性转雌性性逆转胚胎性腺中,Dmrt1表达显著下调;在芳香化酶抑制剂诱导的雌性转雄性性腺中,Dmrt1表达则显著上升.上述研究表明,Dmrt1基因是中华鳖雄性特异性基因,参与雄性性腺的发育过程,可能在中华鳖早期性别决定中起重要的调控作用.     

中华鳖STING基因的克隆及功能分析

为了研究干扰素基因刺激因子STING在中华鳖(Pelodiscus sinensis)先天免疫中的作用, 克隆了中华鳖STING基因(PsSTING)的cDNA序列, 其全长为2145 bp, 包含1152 bp的开放阅读框, 编码383个氨基酸。氨基酸序列比对发现, PsSTING蛋白N端含有4个跨膜区和2个RXR内质网滞留基序, C端有1个解旋酶结构域。qRT-PCR结果显示, PsSTING在中华鳖心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、小肠、胃、皮肤、肌肉和血细胞等组织中均能表达, 其中在脾脏中的表达量最高, 其次是肝脏、小肠和肺, 而在血细胞中的表达量最低; 用嗜水气单胞菌、LPS和poly(I:C)刺激后, PsSTING基因呈现出先上调后下调的趋势, 在刺激12h 时显著高于对照组(P＜0.05), 24h达到最高值, 在48h后逐渐恢复到初始水平, 其蛋白表达量在脾脏和小肠中明显增加。体内RNA干扰后, 小肠中PsSTING的表达量显著下调(P＜0.05), IFN信号通路中TBK1、IRF3、IRF7、STAT6和IFN-β等基因表达水平显著下调(P＜0.05)。在HEK293T细胞中过表达PsSTING基因, 能够显著激活pIFN-β-luc的启动子。研究结果表明PsSTING基因参与调控了中华鳖的先天免疫反应。     

Cyp19a1基因在中华鳖早期卵巢分化中的功能研究

芳香化酶是雌激素合成的关键酶,在非哺乳类脊椎动物的早期雌性性腺分化中起重要的调控作用.本研究首先分析了中华鳖(Pelodiscus sinensis)芳香化酶编码基因Cyp19a1在不同组织及不同发育时期雌雄胚胎性腺中的表达情况;其次,利用芳香化酶抑制剂(AI)和慢病毒RNA干扰及过表达技术,进行Cyp19a1基因的功能验证研究.研究结果表明,Cyp19a1基因在中华鳖成体卵巢组织中高度特异性表达,睾丸和心、肝、脾、肺、肾、肌、肠中未见表达.同时发现,Cyp19a1基因在第18期就呈现雌性性腺特异性表达,早于性腺分化启动时间(第19期).功能缺失实验表明,经过AI及Cyp19a1-shRNA处理后,ZW胚胎性腺皮质区退化,髓质区高度发育,形成原始性索结构,呈现雌性向雄性性逆转现象;同时雌性标记基因Foxl2的表达量下调,雄性标记基因Amh的表达量则显著上调.功能获得实验则表明,Cyp19a1过表达后的ZZ型性腺皮质区高度发育,髓质区退化,形成空洞结构,呈典型雌性特征,同时Foxl2基因的表达量上升,Amh的表达量显著降低.综上所述,本文证明了Cyp19a1是中华鳖早期卵巢分化的关键调控因子,为中华鳖性别分化机制研究奠定了基础.     

中华鳖boule基因在生殖细胞中的表达分析

boule基因为DAZ基因家族成员之一,是动物生殖细胞特异表达基因。在哺乳动物中,boule基因的缺失会引起精子生成障碍而导致雄性不育。在无脊椎动物秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中,boule基因同源物的缺失会引起其卵子发生障碍而导致雌性不育。龟鳖动物是最古老的爬行类,是从无羊膜卵到羊膜卵动物飞跃的过渡物种。相比于哺乳类及一些无脊椎动物,目前关于龟鳖动物生殖细胞发育模式的研究还非常有限。因此,本文以中华鳖(Pelodiscus sinensis)为研究对象,以期揭示boule基因对龟鳖动物生殖细胞发育分化的调控作用。首先,利用特异引物克隆获得中华鳖boule基因的cDNA序列,共1 005 bp,其中,3′端非编码区57 bp,开放阅读框948 bp,共编码315个氨基酸。氨基酸序列多重比对分析显示,中华鳖与绿海龟(Chelonia mydas)同源性最高,达92%,与小鼠(Mus musculus)的同源性达83%,与果蝇(Drosophila melanogaster)的同源性达53%,与青鳉(Oryzias latipes)的同源性达42%。反转录实时定量PCR(RT-qPCR)分析结果显示,中华鳖boulem RNA主要在性腺组织精巢和卵巢中表达,而在其他体细胞组织中几乎检测不到表达。原位杂交结果显示,中华鳖boule m RNA在两性生殖细胞中特异表达,且在不同分化时期的生殖细胞中呈动态表达。在精巢中,boule m RNA在初级精母细胞中表达最强,在精原细胞和次级精母细胞中表达较弱,在精子细胞和精子中难以检测到表达信号;在卵巢中,boule mRNA在初级卵母细胞中表达信号最强且信号在初级卵母细胞胞质中均匀分布,生殖细胞发育进入卵母细胞生长期后,信号开始聚集在核周胞质,随着卵母细胞的成熟,信号逐渐变弱。本研究结果表明,boule基因可能在中华鳖两性生殖细胞的减数分裂过程中均具有重要的调控作用。     

斑马鱼TANK基因的克隆及功能初探

哺乳动物中, TRAF家族相关的NF-κB激活因子(TRAF family member-associated NF-κB activator, TANK)参与调控核因子κB (nuclear factor-κB, NF-κB)信号通路,在硬骨鱼中,最新研究表明TANK在青鱼抗病毒天然免疫反应中具有重要的功能,但在模式动物斑马鱼(Danio rerio)中还没有有关TANK的报道。本研究率先在斑马鱼开展TANK功能研究,克隆并获得了斑马鱼TANK基因(Danio rerio TANK, DrTANK),其编码区(coding sequence, CDS)包括1 047个核苷酸,编码349个氨基酸。免疫印迹实验显示Dr TANK蛋白大小约50 kD;免疫荧光实验证明Dr TANK主要定位于细胞质中,表明其为一种胞质蛋白;双荧光素酶报告基因研究结果显示,在EPC细胞中,过表达Dr TANK并不能显著上调干扰素启动子的表达,但聚肌胞苷酸[poly (I:C)]和草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)的刺激能显著增强其诱导干扰素启动子的表达活性。本研究结果表明Dr TANK在斑马鱼抗病毒天然免疫反应中可能具有重要作用,为后续Dr TANK功能研究奠定了基础。     

ACA基因启动子的克隆及功能初探

根据已知的ACA基因的5’端序列设计三个基因特异的反向引物(GSP-1,GSP-2,GSP-3)分别与11个简并引物(AD1-AD11)配对,进行热不对称嵌套PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)扩增,获得了ACA基因起始密码子上游约700bp的片段。为检测其表达特性,构建了该片段与Gus嵌合基因的表达载体pBpAG,在真空条件下通过农杆菌介导,转化了植物的叶、果实、种子三种不同组织,Gus瞬时表达染色结果显示,该DNA片段具有种子特异的启动子活性?对该启动子的一些顺式元件进行了讨论。     

人神经生长因子基因在大肠杆菌中的克隆、表达及产物纯化

从人胎盘组织中提取总DNA, 经PCR扩增编码人β神经生长因子（β-NGF）成熟肽的基因,并克隆到大肠杆菌表达载体pET15b中。重组质粒pET15b-NGF经测序与报道的完全一致。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达得到16kD的目的蛋白带,与预期的大小一致,NGF表达量约占全菌总蛋白的25%.经过亲和层析柱（Ni2+-charged IDA his-bind column）纯化后得到了单一的NGF蛋白条带,蛋白纯度可达90%以上,从每升表达菌液中可以得到4.56mgNGF。表达产物的Western 印迹鉴定结果显示：重组人神经生长因子能与兔抗人β-NGF的多克隆抗体发生特异性结合反应,在16kD处出现单一的条带,表明诱导表达的重组NGF具有免疫学活性。鸡胚背根神经节感觉神经元鉴定试验表明,本实验表达的重组NGF具有良好的生物学活性。     

乙肝病毒表面抗原基因在胡萝卜中的克隆及表达

构建HBV表达抗原（HBsAg)植物表达载体并在胡萝卜植株中表达。采用自行构建adr亚型HBsAg基因克隆T-adr,再次酶切获得860bp含PreS2的HBsAg基因片段,将其插入到植物表达载体pBPC55,新质粒命名为pBPC91adr。将其与含除草剂抗性基因及GUS蛋白基因的筛选质粒pBPC93共同经基因枪（PDS-1000/He)转化胡萝卜悬浮细胞,经含除草剂（Biolaphos)的培养基筛选及植物激素诱导分化,获得除草剂抗性胡萝卜幼苗,结果为转化后8周,自胡萝卜细胞中分化出除草剂抗性胡萝卜幼苗,提取新分化幼苗总DNA,特异性引物PCR扩增后可见860bp扩增带;Southern-Blot证明有HBsAg基因整合,胡萝卜蛋白萃取物的Western-Blot及ELISA检测证实有HBsAg蛋白表达。利用基因枪转化使质粒pBPC91adr中HBsAg基因在胡萝卜幼苗内整合并表达,提示以植物生产疫苗具有可行性。     

大肠杆菌UvrB基因的克隆、表达与功能研究

[目的]在大肠杆菌表达系统表达UvrB蛋白,优化其表达和纯化的条件,并初步研究其对抗紫外线伤害的功能。[方法]克隆大肠杆菌MG1655菌株UvrB编码序列,采用酶切连接的方法构建表达载体p Waldo-GFP-UvrB,并转入BL21(DE3)表达菌株诱导蛋白质表达,采用Ni-NTA亲和层析以及分子筛层析的方法纯化蛋白质,采用紫外光刺激的方法研究其细胞内功能。[结果]成功构建UvrB表达载体,获得UvrB在BL21(DE3)中重组菌株,其表达条件为22℃,0. 2 mmol/L IPTG诱导20 h,UvrB以可溶蛋白的形式存在。SDS-PAGE结果显示UvrB蛋白质分子量约76 k Da与预期相符;经纯化后UvrB蛋白质得率约为0. 6 mg/L培养基,纯度> 85%,为其进一步研究奠定了基础。[结论]研究克隆并构建了大肠杆菌UvrB蛋白的原核表达体系,优化了其纯化方案,得到纯度> 85%的可溶UvrB蛋白质,为进一步研究UvrB蛋白质功能奠定了基础。     

人防御素6基因的克隆、亚克隆及在酵母中的分泌表达

探讨人防御素6(HD-6)在毕赤酵母中表达的可行性,为进一步研究HD6的功能提供理论依据和实验基础。采用PCR方法,设计引物从cDNA文库中扩增出人α防御素6基因片段,并将其插入到克隆载体pMD-18T中,再与毕赤酵母表达载体pPICZαA重组,以得到重组的HD-6酵母表达载体pPICZαA/HD-6,并进行琼脂糖电泳和测序鉴定。再将构建好的毕赤酵母重组表达质粒pPICZαA/HD-6经SacⅠ线性化后,应用LiCl法转化毕赤酵母菌株GS115感受态中,Zeocin平板筛选,PCR鉴定转化子。经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDSPAGE分析重组HD-6的表达。从cDNA文库中扩增出的HD-6基因片断大小正确;电泳和测序结果均证明已将此片段克隆到酵母表达载体pPICZαA内;线性化的重组质粒pPICZαA/HD-6成功转化进入毕赤酵母感受态中,PCR鉴定结果与预期相符;蛋白电泳证实重组HD-6在酵母中获得分泌表达。提示重组HD-6可以在毕赤酵母中实现分泌表达。     

天花粉蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

天花粉蛋白 (Trichosanthin ,TCS)全长基因通过PCR从 pCDNA3 1中获得 ,克隆至表达载体中。双向测序表明获得的天花粉蛋白全长基因序列正确。建立大肠杆菌原核表达系统 ,表达并纯化His TCS活性融合蛋白 ,鉴定出其具有RNAN 糖苷酶活性和与TCS特异性单克隆抗体TE1 (IgE)结合的抗原活性     

蚓激酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

以赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)体内的总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增含自身信号肽的蚓激酶基因F238,将其克隆到pUCm-T载体上,并进行测序。GenBank登录号为:DQ202401。测序结果表明基因全长为738bp,共编码245个氨基酸,包括7个氨基酸的信号肽序列和238个氨基酸的成熟肽序列。与粉正蚓(Lumbricus rubellus)F-III-2相比,核苷酸与氨基酸序列的同源性均为99%,仅存在2个碱基的差异,导致2个氨基酸的突变。通过生物信息学方法对蛋白质的理化及结构特性进行分析预测,F238的等电点为4.61,含有11个半胱氨酸,形成3个二硫键。蛋白质分子主要由β折叠组成,具有丝氨酸活性中心,属丝氨酸蛋白酶超家族胰蛋白酶类。以重组质粒pUCm-T-F238为模板,通过PCR方法扩增去信号肽的蚓激酶基因F238-m,构建毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9-F238-m,将其线性化后用电穿孔法导入酵母宿主菌GS115中。在MM和MD平板上筛选表型,经甲醇诱导后,SDS-PAGE分析显示表达产物的分子量为28kDa左右,纤维平板法测定活力最高可达100U/mL。     

抗菌肽-X基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR技术获得抗菌肽—X基因、TNFα基因,与温度诱导的表达载体pRC连接成为重组表达载体,导入大肠杆菌TG1,通过温度诱导表达重组蛋白。将重组质粒转入不同的表达菌中进行表达,经SDS—PAGE选出E.coil BL21(DE3)为最佳表达的宿主菌。培养后,离心得菌体,经超声破碎离心得包涵体,溶解后用CNBr切割并透析,最后经CM52纤维素柱分离纯化得到有活性高纯度的抗菌肽—X。     

家鸡GPR15基因的克隆、功能探究及组织表达分析

孤儿受体G蛋白偶联受体15(GPR15)在哺乳动物肠道稳态以及炎症反应中发挥重要生理效应,但在非哺乳动物中,针对GPR15的研究几属空白。本文以家鸡Gallus gallus domesticus为模型,首次克隆了GPR15基因,并对其功能与组织表达进行了探究。结果显示:家鸡GPR15编码区cDNA长度为1 107 bp,由1个外显子组成,可编码368个氨基酸的受体蛋白。序列分析表明家鸡GPR15是具有7次跨膜结构的G蛋白偶联受体,且家鸡GPR15与人Homo sapiens、北美绿蜥蜴Anolis carolinensis、小鼠Mus musculus的GPR15具有约56%的氨基酸序列一致性;虽然系统进化树分析表明GPR15与爱帕琳肽受体(APLNR)有较近的进化关系,但在表达家鸡GPR15的HEK293细胞中,APLNR的内源性配体Apelin和Apela不能激活家鸡GPR15;此外,实时定量PCR分析发现GPR15在家鸡脾脏中高表达,在盲肠、肺中有中等水平表达,而在其他组织中微弱表达。上述结果为探究GPR15在禽类中的生理功能奠定了基础。     

ACA基因启动子的克隆及功能初探

根据已知的ACA基因的 5 '端序列设计三个基因特异的反向引物 (GSP-1,GSP-2 ,GSP-3)分别与 11个简并引物 (AD1-AD11)配对 ,进行热不对称嵌套PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR ,TAIL-PCR)扩增 ,获得了ACA基因起始密码子上游约700bp的片段。为检测其表达特性 ,构建了该片段与Gus嵌合基因的表达载体pBpAG ,在真空条件下通过农杆菌介导 ,转化了植物的叶、果实、种子三种不同组织 ,Gus瞬时表达染色结果显示 ,该DNA片段具有种子特异的启动子活性。对该启动子的一些顺式元件进行了讨论。     

人载脂蛋白AⅠ基因的克隆表达及功能

To identify, clone ,sequence and highly express the mature peptide gene of ApoA Ⅰ, total RNA was prepared from human fetal liver tissue. cDNA fragment encoding human ApoA Ⅰ was amplified by RT-PCR using specific primers, and then was inserted in pGEM-T vector. DNA sequencing indicates that the fragment is 729 base pairs in length and has 100% nucleotide homology with that of reported ApoA Ⅰ cDNA gene previously. The ApoA Ⅰ gene was cloned into pGEX 5X-1.The recombinant protein was expressed in E.coli DH5α, purified by glutathione-Sepharose 4B affinity chromatography and confirmed by SDS-PAGE. It was shown that the recombinant ApoA Ⅰ was expressed in E.coli, and the target protein amounted to 36% of total bacteria proteins. Cholesteryl ester transfer experiment showed that the recombinant ApoA Ⅰ was capable of promoting transfer of CE from HDL to LDL. Western blotting showed that the protein could react specifically with anti-ApoA Ⅰ antibodies.     

油橄榄HMGR基因家族的克隆表达及功能验证

3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR),催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-Co A)生成甲羟戊酸(MVA),是MVA途径中第一个关键酶。油橄榄是一种重要的经济油料作物,其含有的萜类物质具有重要营养价值,但关于调控萜类物质代谢途径的关键基因研究较少。为研究萜类合成途径关键酶基因HMGR,本研究采用RT-PCR法克隆油橄榄HMGR基因,进行生物信息学分析及构建原核表达载体,对表达蛋白生物活性进行功能验证,并采用荧光定量PCR分析HMGR在油橄榄不同生长阶段的表达量。结果表明:克隆出油橄榄HMGR基因家族的三个基因,分别命名为Oe HMGR1、Oe HMGR2、Oe HMGR3,m RNA ORF的长度分别为1 713 bp、1 773 bp、1 737 bp,编码570、590、578个氨基酸;基因编码蛋白均有2个跨膜区及HMGR催化活性的结构域,不含信号肽;构建了原核表达载体p ET30b(+)-Oe HMGR,转入到大肠杆菌BL21中成功表达,3个重组酶蛋白分子量大小均在66.2~68.0 k D之间,分离纯化重组蛋白进行功能验证,GC-MS检测表明该蛋白具有HMGR催化活性功能;荧光定量PCR分析表明该家族基因在果实和叶片中表达量较高,而在根、茎、花中表达量较低,在开花后45 d、90 d、120 d表达量较低,但在花后165 d表达量上升至较高水平。该研究为进一步鉴定Oe HMGR的功能及油橄榄萜类物质的合成生物学研究奠定基础。