实时荧光定量PCR中内参基因的选择

实时荧光定量PCR技术是分析基因表达谱的一种常用方法,在分析中选择合适的内参基因对数据进行校正是得到可信数据的关键。以Lactobacillus helveticus H9为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,评价了5种常用内参基因ldh、recA、rpoB、gapdh和16S rRNA的表达稳定性,通过geNorm和NormFinder程序进行数据分析,结果表明5个候选内参基因在菌株不同的发酵时间点表达相对都较为稳定,结合两种分析得到其中最为稳定的基因是ldh,适合于用作后续实时荧光定量PCR试验中的内参基因。     

植物实时荧光定量PCR内参基因的特点及选择

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)具有灵敏度高、特异性强、重复的动态定量范围和高通量等优点,是进行植物基因表达和转录分析最常用的技术手段之一.选择合适的内参基因是正确运用实时荧光定量PCR分析目标基因表达变化的前提.近年来,大量研究表明,内参基因的选择应取决于研究者的实验条件;随着实验条件的变化,内参基因的选择也随之变化.因此,实时荧光定量PCR结果分析的准确性在很大程度上依赖于所选择的内参基因是否适合.该文从内参基因的选择、常用内参基因的特点、新内参基因的挖掘、应用内参基因组合的优点和内参基因的稳定性评价等几方面进行综述,以期为研究者在实验中选择合适的内参基因提供参考和理论依据.     

茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析(qRT-PCR)准确性的先决条件。该文以茶树(Camellia sinensis) 芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织为材料, 应用实时荧光定量PCR技术, 分析了18S rRNA、GAPDH、β-actin和α-tubulin 4个常用内参基因在茶树不同器官组织中的表达情况。经GeNorm和NormFinder软件分析发现, 当利用荧光定量PCR分析比较茶树不同器官组织中的基因表达差异时, 可选择β-actin作为校正内参基因; 而比较不同成熟度的叶片和愈伤组织时, 可以选择GAPDH作为校正内参基因。     

黄梁木实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

为筛选黄梁木(Neolamarckia cadamba)实时定量PCR最佳内参基因, 该研究以黄梁木的根、芽、叶、花、果、皮及形成层为材料, 利用RT-qPCR技术对ACT、CAC、CYP和EF1α等21个管家基因家族43个候选内参基因进行表达量分析, 并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行内参基因稳定性分析。geNorm的分析结果显示, UPL基因的稳定性最高(M=0.443), UBQ基因的稳定性最低(M=2.859); NormFinder的分析结果显示, UPL基因的稳定性最高(E=0.223), UBQ基因的稳定性最低(M=4.759); BestKeeper分析显示, UPL基因的标准偏差(SD=0.513)最低。研究结果表明, UPL基因作为内参基因稳定性最高, UBQ基因的稳定性最低。因此可以选择UPL基因作为黄梁木不同组织中RT-qPCR定量分析的内参基因。     

茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析（qRT-PCR）准确性的先决条件。该文以茶树（Camellia sinensis）芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织为材料,应用实时荧光定量PCR技术,分析了18S rRNA、GAPDH、β-actin和α-tubulin4个常用内参基因在茶树不同器官组织中的表达情况。经GeNorm和NormFinder软件分析发现,当利用荧光定量PCR分析比较茶树不同器官组织中的基因表达差异时,可选择β-actin作为校正内参基因;而比较不同成熟度的叶片和愈伤组织时,可以选择GAPDH作为校正内参基因。     

黑木耳实时荧光定量PCR内参基因的筛选

黑木耳Auricularia heimuer是我国主要栽培的食用菌之一,具有较高的经济价值和生态价值。本研究以黑木耳不同菌株（A14、A137和A12）和不同生育期的样品（菌丝体、原基和子实体）为实验材料,提取RNA,反转录成cDNA,在全基因组注释结果的基础上,选择12个候选内参基因（APRTase、β-TUB、RPL2、EF-1a、EF-2、PGI、PGM、H ⁺-ATPase、Tspd、TUB-1a、18S rRNA和28S rRNA）并设计跨内含子的引物,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术进行扩增,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt算法以及综合评价软件RefFinder,筛选适宜的内参基因。结果表明18S rRNA、β-TUB、EF1-a和28S rRNA适宜作为不同菌株的内参基因,APRTase、18S rRNA和28S rRNA适宜作为不同生育期的内参基因。     

黄精实时荧光定量PCR内参基因的筛选

本研究采用实时荧光定量PCR(quantitative Real-t Time PCR,q RT-PCR)筛选适用于黄精(Polygonatum sibiricum)的内参基因。利用黄精转录组数据库,筛选8个候选内参基因,18S核糖体r RNA基因(18S-r RNA,18S)、肌动蛋白基因(Actin,ACT)、细胞色素基因(cytochrome,CYP)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、α-微管蛋白基因(α-Tubulin,TUA)、β-微管蛋白基因(β-Tubulin,TUB)、多聚泛素酶基因(ubiquitin 5,UBQ 5)和(ubiquitin 10,UBQ 10)。应用q RT-PCR技术检测这8个候选内参基因在黄精不同组织器官中(根,根茎,茎,叶,花和种子)的表达情况。利用Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种统计学软件综合评价8个内参基因的表达稳定性。研究结果表明,TUB在黄精不同组织部位中表达稳定性最好,运用q RT-PCR技术研究黄精器官基因表达时,可选用TUB作为内参基因。确定黄精q RT-PCR分析的合适内参基因,为后续相关基因表达研究奠定基础。     

绿豆象实时荧光定量PCR内参基因的筛选

绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性。结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异。不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的...     

桃蛀螟实时荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选特定条件下桃蛀螟Conogethes punctiferails稳定表达的内参基因,为桃蛀螟基因定量研究奠定基础。【方法】参考文献报道,并根据桃蛀螟转录组测序结果筛选出β-肌动蛋白基因ACT、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、核糖体蛋白49基因RP49、α-微管蛋白基因α-tub、核糖体蛋白L13基因RPL13和液泡型ATP合酶基因V-ATPase等6个候选基因。再利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定6个候选基因在桃蛀螟不同发育时期和成虫不同组织中的表达量;然后通过ΔCt法,Ge Norm,Norm Finder,Best Keeper和Ref Finder 5个软件对6个候选基因的稳定性进行评估;最后以桃蛀螟嗅觉受体基因(olfactory receptor co-receptor,Orco)和性信息素结合蛋白基因(pheromone binding protein1,PBP1)为目的基因,验证6个候选基因分别在桃蛀螟不同发育时期和成虫不同组织中的的稳定性。【结果】ΔCt法,Ge Norm,Norm Finder和Best Keeper分析结果表明,4个软件对6个候选基因稳定性的排序相似,在桃蛀螟不同发育时期和成虫不同组织中稳定性较高的3个基因为RP49,RPL13和GAPDH;同时4个软件均判定ACT的稳定性最低。进一步利用Ref Finder进行综合分析,结果显示,在桃蛀螟成虫不同组织中,最稳定的基因为RPL13,其次为RP49;而在不同发育时期,最稳定的基因为RP49,其次为GAPDH。另外经Ge Norm软件计算得出,在桃蛀螟不同发育时期和成虫不同组织中桃蛀螟内参基因的最佳数目为2。最后,以嗅觉受体基因Orco和PBP1为目的基因,对筛选出的候选基因的稳定性进行验证,发现当使用RPL13和RP49以及RP49和GAPDH作为内参基因时,Orco及PBP1的表达量规律一致,并与桃蛀螟生活习性及前人研究结果一致;而使用ACT作为内参基因计算得到的Orco和PBP1表达量则不规律。【结论】在不同发育时期桃蛀螟基因定量研究中建议以RP49和GAPDH作为内参基因,而在桃蛀螟成虫不同组织中基因定量研究中建议以RPL13和RP49作为内参基因。     

华细辛实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

选择合适的内参基因是准确分析目标基因表达水平变化的重要条件。选取SAND-1、ACT、18Sr RNA、CYP2、GAPDH、TUB 6个常用的内参基因作为候选内参基因,利用实时荧光定量PCR技术,通过ge Norm、Norm Finder、Best Keeper、Delta CT等软件分析和评价6个候选内参基因在华细辛营养生长期、花期和花后期等不同生长阶段的根、根茎、叶片、叶柄等不同组织中的表达稳定性,筛选适宜华细辛不同生长阶段不同组织基因表达水平分析的内参基因。结果表明,18S r RNA在华细辛所有样品中表达最为稳定,是进行华细辛基因表达水平分析的适宜的内参基因。研究结果可为华细辛重要活性成分生物合成途径相关基因的功能分析,以及基因差异表达的研究提供有效的校正工具,确保基因表达分析结果的准确性与可靠性。     

冬虫夏草菌实时荧光定量PCR内参基因的筛选

以冬虫夏草单子囊孢子分离得到的菌株TZ8-1的3种菌丝形态为实验材料,提取RNA,经反转录获取cDNA,选择了 11个持家基因为候选内参基因(18SrRNA、APRTase、β-TUB、RPL2、EF1-α、PGI、PGM、H+-ATPase、ACT1、UBQ和GAPDH),根据该菌基因组注释结果来设计引物,采用实时荧...     

杂交兰实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为了给杂交兰的基因功能表达和调控研究提供内参基因,本研究采取同源克隆方法和RT-PCR技术,以杂交兰‘黄金小神童’叶片为材料,分离杂交兰Ch18S r RNA、Ch28S r RNA、Ch ACT、Ch TUA、Ch TUB、Ch UBQ、Ch EF-1α和Chrpo B基因的片段,以10个不同品种杂交兰叶片及‘黄金小神童’花器官不同部位为材料,利用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,q PCR)检测分析各引物的扩增效率和相对表达量,采用ge Norm、Norm Finder和Best Keeper软件对各个候选内参基因的表达稳定性进行分析,并通过研究杂交兰花器官不同部位Ch PDS基因的表达模式来验证筛选得到的内参基因的可靠性。结果显示,各引物扩增的片段长度分别为171 bp、148 bp、183 bp、146 bp、130 bp、147 bp、203 bp、139 bp,扩增效率分别为1.94、2.19、1.88、1.99、2.12、2.20、2.11、1.98。综合3个软件的评价结果发现,杂交兰不同品种叶片中最佳内参基因为Ch ACT,不同花器官部位中最稳定内参基因为Ch ACT、Ch TUB、Ch UBQ和Ch EF-1α;而对于实验中所有样品来说,内参基因稳定性最高的为Ch TUB;说明不同的实验条件下,所需的内参基因不同。Ch PDS基因相对表达水平分析结果证实了所筛选内参基因的可靠性,以Ch UBQ、Ch EF-1α、Ch TUB、Ch ACT及Ch UBQ和Ch EF-1α基因组合进行校正的Ch PDS基因的相对表达量均为花瓣唇瓣蕊柱。     

内参基因在昆虫实时荧光定量PCR中的研究进展

作为一种高效的定量PCR技术,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)因其灵敏度高、特异性强、定量准确等优点,已被广泛运用于昆虫基因表达和转录分析。然而,为了控制样本RNA在质量和逆转录效率上存在差异,必须筛选表达稳定的"看家基因"作为内参基因,对目的基因表达量进行校正和标准化。许多学者研究表明,昆虫种类和实验条件的不同,导致选择的内参基因也不尽相同。因此,本文综述了前人有关昆虫内参基因的研究及其稳定性评价,为其它昆虫内参基因的研究提供理论参考依据。     

岩白菜实时荧光定量PCR分析的内参基因的筛选

本研究为筛选在岩白菜中稳定表达的内参基因,以用于岩白菜实时荧光定量PCR研究,以岩白菜的幼叶、成熟叶、叶柄、根、一年生根状茎和二年生根状茎为材料,采用实时荧光定量PCR技术比较了GAPDH、18S rRNA、β-actin、TUA、UBQ5和TUB等6个候选内参基因的表达情况,并经Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper等3种软件分析,分析表明6个候选内参基因在岩白菜不同器官中的表达情况存在差异,其中GAPDH和18S rRNA的表达都较为稳定,可作为岩白菜实时荧光定量PCR分析的内参基因。     

火龙果溃疡病菌实时荧光定量PCR内参基因的筛选

火龙果溃疡病是由火龙果溃疡病菌引起的重要真菌病害,近年来在世界火龙果产区的爆发严重影响了火龙果产业的发展。为研究火龙果溃疡病菌响应逆境胁迫的基因表达和功能,需要筛选火龙果溃疡病菌在各种条件下表达稳定的内参基因。以火龙果溃疡病菌菌株LJ02为研究对象,以在马铃薯葡萄糖液体培养基（PDW）培养的菌丝体为对照组,以在LB培养基培养的菌丝体和分别在添加过氧化氢、吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑的PDW培养的菌丝体为处理组。利用实时荧光定量PCR技术以及内参基因稳定性评估软件（geNorm、NormFinder、Bestkeeper和RefFinder）,评估18个候选内参基因（CYT1、SDH2＿1、TBCC、SUI1、RPL19、PPH、ATP5B、UBE2＿16、RPL13、UBE2＿2、PRS17、SUCLA2、ATP5A、TUB1＿2、ACT1、EFTU、EF1A和GAPDH）的表达稳定性。结果显示,火龙果溃疡病菌的18个候选基因在上述培养条件下的Ct值介于14.80-24.66之间,表达水平适中;稳定性最高的内参基因是CYT1,其次为SUI1,GAPDH和ACT1的稳定性最差;最少使用2个内参...     

梨小食心虫实时荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】本研究旨在探明梨小食心虫Grapholita molesta在不同发育阶段、成虫不同组织以及不同浓度的3种杀虫剂处理后成虫中稳定表达的内参基因,为后续对梨小食心虫目的基因表达的研究奠定基础。【方法】基于梨小食心虫转录组数据筛选10个候选内参基因(β-actin, 18S rRNA,β-tubulin,EF-1α,RPL13,RPL32,RSPL40,UBC7,α-tubulin和RPS20);通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定候选内参基因在梨小食心虫不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、蛹和成虫)、成虫不同组织(头、前肠、中肠、后肠、脂肪体、马氏管、精巢和卵巢)以及不同浓度的3种杀虫剂(阿维菌素：19.819, 72.897和179.663μg/mL;吡虫啉：17.638, 163.323和762.986μg/mL以及高效氯氟氰菊酯：33.791, 96.123和198.282μg/mL)通过玻璃管药膜法处理后成虫中的表达量;利用geNorm, NormFinder,ΔCt, BestKeeper和RefFinder对10个候选内参基因的表达稳定性进行评价。选择梨小食心虫细...     

藜科植物藜和灰绿藜实时荧光定量PCR内参基因的选择

选择合适的内参基因是实时荧光定量PCR(qRT-PCR)研究的关键,目前对藜科耐盐(盐生)植物胁迫相关基因的表达分析中所用内参基因的报道较为有限.该研究利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3个内参基因分析软件,对已选择过的β-TUBULIN、β-ACTIN、GAPDH 3个常用候选内参基因进行了比较分析,筛选出在NaCl和PEG胁迫下藜和灰绿藜中表达相对稳定的内参基因.结果表明:GeNorm、NormFinder内参软件分析在NaCl和PEG胁迫下,GAPDH是藜和灰绿藜中均共同稳定表达的内参基因,同时在藜和灰绿藜中也有各自表达较稳定的内参基因,β-ACTIN在藜中稳定表达,β-TUBULIN则在灰绿藜中稳定表达.对相同科不同种的植物内参基因表达差异进行比较,内参基因在相同科中具有相同稳定表达的内参;对相同胁迫下两种不同植物内参基因表达稳定性进行分析,内参基因的选择需根据实际的实验材料和实验条件而定.基于3个分析软件对以上3个常用内参基因的分析结果,初步确定了在藜科植物藜和灰绿藜中相对稳定的内参基因,为藜和灰绿藜胁迫相关基因的定量表达分析提供了参考依据.     

实时荧光定量PCR相对定量法检测循环miRNA的内参选择

microRNA(miRNA)是一类内源性非编码微小RNA,在调控细胞增殖、分化、凋亡等方面发挥重要作用。研究发现,miRNA能够稳定存在于细胞外液,被称为循环miRNA。在多种疾病状态下循环miRNA表达谱改变,具有成为非创伤性新型生物标志物的潜能。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)是检测miRNA表达变化的确证实验,其中内参的选择关系到相对定量结果是否真实可靠。我们简要综述国内外实验室常用的RT-qPCR内参及其特点。     

桉蝙蛾幼虫实时荧光定量PCR内参基因的筛选

本研究通过筛选桉蝙蛾Endoclita signifer Walker幼虫不同龄期与不同体节中稳定表达的内参基因,为桉蝙蛾基因表达研究提供参考。通过实时荧光定量PCR技术测定5个候选内参基因（ACTIN、GAPDH、TUB、RIB、EF）在桉蝙蛾幼虫不同龄期（3龄、5龄、9龄、12龄）与不同体节（头部、胸部、腹部）及全样品（由所有样品组成）处理中的表达量,后利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper对5个候选基因的稳定性进行评估,最后由RefFinder综合分析结果,选出最佳的内参基因。基于4种分析方法的评估可知,桉蝙蛾5龄和9龄幼虫的不同体节、不同龄期幼虫的头部和胸部中内参基因的最佳数目为2,而3龄和12龄幼虫的不同体节、不同龄期幼虫的腹部及全样本中内参基因的最佳数目为3。3龄、5龄、9龄和12龄幼虫的不同体节中可分别选择ACTIN+RIB+GAPDH、EF+RIB、GAPDH+EF和ACTIN+RIB+GAPDH作为最稳定的内参基因组合;EF+RIB、RIB+GAPDH和EF+GAPDH+ACTIN可分别作为不同龄期幼虫头部、胸部和腹部的最佳内参基因组合;综合考虑桉蝙蛾幼虫不同龄期与不同体节的影响时,可选择RIB、ACTIN和GAPDH作为内参基因。     

实时荧光定量PCR分析蒙古韭低温诱导叶片中内参基因的选择

实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)是广泛应用于基因表达分析的实验技术。在基因表达分析过程中,选择稳定表达的内参基因对实验结果的准确性非常重要。以低温诱导24 h和72 h蒙古韭(Allium mongolicum)的叶片为材料,无处理0 h叶片为对照,使用荧光定量PCR法分析了Am5S-rRNA、AmActin、AmGAPDH和AmEF1-α4个看家基因的表达情况。通过ge Norm和NormFinder程序分析,发现AmGAPDH稳定性最好,Am5S-r RNA和AmActin次之,AmEF1-α稳定性最差,因此选择AmGAPDH作为蒙古韭基因表达分析的内参基因。本研究通过qRT-PCR方法分析稳定表达的内参基因,对后续蒙古韭低温诱导基因表达分析有重要的意义。