苦荞多肽的纯化、结构与体外抗氧化活性研究CSCD

为了探究苦荞多肽粗提液抗氧化活性的主要来源,需要进一步对苦荞多肽进行分离纯化,通过结构鉴定来分析抗氧化活性与多肽结构之间的关系。该研究以苦荞功能提取物废渣为原料提取苦荞粗蛋白辅以植物乳杆菌发酵法制备苦荞多肽,采用大孔吸附树脂、葡聚糖凝胶、液相色谱对苦荞多肽粗提液进行分离纯化,并以抗氧化活性为指标,筛选抗氧化活性较强的组分,利用液相色谱-质谱联用技术鉴定抗氧化多肽结构。结果表明,纯度不同的苦荞多肽抗氧化能力也不同,经过Sephadex G-15葡聚糖凝胶分离纯化得到的T-3组分ABTS和DPPH自由基清除能力最优,清除率分别为96%、94%。纯化后苦荞多肽的抗氧化活性显著高于粗提液(P<0.05),但是抗氧化活性并没有完全与苦荞多肽纯度呈正相关,通过液相色谱进一步分离纯化T-3组分后得到的组分T-3-1,苦荞多肽纯度虽然达到了98%,但是对DPPH和ABTS抑制率不再增强,反而稍有下降,抑制率分别为89%和90%。由质谱鉴定结果得到,主要抗氧化肽的氨基酸序列为苯丙氨酸-脯氨酸-酪氨酸Phe-Pro-Tyr(FPY)和酪氨酸-亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸Tyr-Leu-Pro-Phe(YLPF)。研究结果以期为苦荞多肽的进一步开发利用提供一定的理论基础。     

RP-HPLC分离制备桔梗皂苷

在对桔梗总皂苷粗分的基础上,利用制备高效液相色谱分离制备桔梗单体皂苷,共分离得到四个化合物,经波谱法分别鉴定为platycodinD（1）,platycoside E（2）,deapio-platycoside E（3）,未知化合物（4,鉴定中）,经HPLC分析,纯度均大于98％．对比以前的分离手段,该方法分离制备桔梗单体皂苷工艺简单,效率高,为在桔梗中寻找新的天然活性物质提供了新方法。     

氨基酸制备色谱——丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸制备柱柱效率研究

现代液相色谱已从分析色谱发展到制备色谱,为了研究氨基酸制备色谱柱柱效率,我们从液相色谱理论的十几个基本关系式中归纳出五个基本方程式,用以评价丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸制备柱柱效率。初步试验结果表明,对强酸性阳离子交换树脂柱而言: 1.凝胶型离子交换树脂柱柱效率高于普通大孔型离子交换树脂柱柱效率,而与本室合成的Dpsc大孔型离子交换树脂柱柱效率相当。 2.凝胶型离子交换树脂中,低交联度离子交换树脂有利于提高缬氨酸和亮氨酸制备柱柱效率,可较好地分离缬氨酸和亮氨酸;较高交联度离子交换树脂有利于提高丙氨酸和缬氨酸制备柱柱效率,可较好地分离丙氨酸和缬氨酸。将不同的离子交换树柱组合起来,可以提高丙氨酸,缬氨酸和亮氨酸的分离度,提高氨基酸的回收率。这项研究成果已应用到从猪血粉、猪毛等天然蛋白质酸水解物中系统分离多种氨基酸,以及分别从缬氨酸、亮氨酸(异亮氨酸)发醇液中分离纯化缬氨酸、亮氨酸(异亮氨酸)。     

一组新的沙蚕蛋白酶同工酶的分离纯化与鉴定

分离纯化一组新的沙蚕蛋白酶同工酶,并对其性质进行鉴定.用硫酸铵盐析、凝胶过滤层析和疏水层析技术从沙蚕中分离得到了沙蚕蛋白酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、高效液相色谱（HPLC）、等电聚焦电泳（IEF）和质谱分析（MS）鉴定,发现沙蚕蛋白酶由3个组分组成,均有纤溶活性,其等电点为3.5～4.5,分子量分别为29 248.75、29 007.66、28 954.17,肽指纹图谱分析发现,它们均为未知的新蛋白质,其中2个组分结构相似,具有较高的同源性,与另1个有不同.用抗原抗体反应鉴定其免疫原性,发现3个组分中有2个组分具有相同的免疫原性,另1个组分与2者不同.但3者具有相同的抗原决定簇,证明沙蚕蛋白酶由2个同工酶组成.以4种专一性的抑制剂对其进行抑制,检测酶的活性确定其酶学性质,发现其反应的适宜温度为40℃～50℃、适宜pH值为8～9.沙蚕蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶.     

蓝光胁迫对金线莲游离氨基酸组分的影响

以金线莲(Anoectochilus roxburghii)为试材,在光密度30 μmol·m–2s–1的白光基础上补充60 μmol·m–2·s–1、120 μmol·m–2·s–1和180 μmol·m–2·s–1三个强度蓝光胁迫56 d,采用氨基喹啉-N-羟基丁二酰氨基甲酸酯(AQC)柱前衍生结合超高效液相色谱-串联质谱法测定游离氨基酸组分含量变化,分析金线莲游离氨基酸组分对蓝光胁迫的响应特征。共稳定检测出22种氨基酸,苏氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、肌氨酸、组氨酸、天冬酰胺和酪氨酸是金线莲的特征氨基酸,游离氨基酸总量随着胁迫时间延长呈先增加后减少的趋势,在14 d 时含量最高。综合结果表明,蓝光胁迫14?d对金线莲中多种游离氨基酸的合成有促进作用,在补充180 μmol·m–2·s–1强度蓝光时效果最好。     

乌龙茶水提物的膜分离制备及其体外抗氧化活性评价

为探究乌龙茶水提液的不同膜分离工艺对产品品质、生化成分及体外抗氧化活性的影响,采用陶瓷膜(500 nm)和超滤膜(20、10、5、3.5 kD)对乌龙茶水提液进行分离,经喷雾干燥制得茶粉。通过感官品质、物理性质等方面评价不同膜分离工艺所制备的茶粉品质,并对茶粉的主要生化成分进行分析比较。同时,通过DPPH自由基清除力、FRAP氧化还原力、羟基自由基清除力、抗超氧阴离子活力方法评价茶粉的体外抗氧化活性。结果表明,陶瓷膜透过液的感官品质综合得分最高,体外抗氧化活性亦最高。500 nm陶瓷膜可有效分离与富集茶多酚(TPs)、游离氨基酸(FAAs)、咖啡碱(CAF)、可溶性糖(SPS)等物质,还可达到除杂效果,经陶瓷膜分离后的乌龙茶水提液再经超滤膜分离,对TPs、CAF、SPS、儿茶素组分无分离与富集效果。截留分子量小于10 kDa的超滤膜可有效分离与富集游离氨基酸。500 nm陶瓷膜截留液的SPS含量最高,但综合感官品质最差,抗氧化活性最低。基于品质、功效、节能3大要素考虑,500 nm陶瓷膜透过液制备的茶粉综合品质最优。     

增强型绿色荧光蛋白在集胞藻6803中的表达

利用聚球藻7942热休克基因groESL的启动子和报告基因egfp,构建了表达载体pUC-Tegfp并转化集胞藻6803,并通过所制备抗体对转基因藻进行蛋白免疫印迹检测.结果发现,在转基因藻株T-egfp的细胞粗提液中含有能与eGFP抗体特异结合的蛋白质,表明外源增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)在集胞藻6803中成功表达.     

水稻高脯氨酸愈伤组织变异体盐胁迫下氨基酸和蛋白质组分的变化

游离氨基酸组分分析表明,水稻培养细胞中谷氨酸和丙氨酸含量很高,占氨基酸总量的４０％。高脯氨酸愈伤组织变异体总游离氨基酸含量比原型高４５．５％,其中脯氨酸增加最多,其次是丙氨酸和谷氨酸。当ＮａＣｌ１００ｍｍｏｌ／Ｌ处理时变异全和原型的总氨基酸都增加,而变异体的增量约为原型增量的３倍。蛋白水解氨基酸组分中变异体和原型各氨基酸的相对含量无大差异。蛋白质双向电泳表明,高脯氨酸变异体的蛋白组分发生变化,明显     

草地藏系绵羊乳游离氨基酸质量分数及蛋白遗传多态性研究

用反相高效液相色谱法检测草地藏系绵羊乳游离氨基酸质量分数,用聚丙烯酰胺凝胶电泳法研究乳蛋白组分及其遗传多态性。结果表明:草地藏系绵羊乳中检测到17种游离氨基酸,其中质量分数最高的为Arg;与金堂黑山羊乳比较17种游离氨基酸中,甲硫氨酸的质量分数极显著高于金堂黑山羊(p<0.01),而天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸和缬氨酸的质量分数均显著低于金堂黑山羊(p<0.05),其余9种游离氨基酸质量分数未发现明显差异,但两种羊乳中的必需氨基酸总量基本相同,差异不明显(p>0.05)。草地藏系绵羊乳蛋白组分主要包括α-La、β-Lg、CN、IgG等,CN的相对质量分数约50%~52%;研究还发现4种分子量类型的乳上皮粘蛋白MUC1,分子量分别为214kD、209kD、207kD、205kD;CN、β-Lg均未检测到多态性,说明草地藏系绵羊乳蛋白遗传多态性较为贫乏。     

蛋白质组研究中分离新技术与新方法

对于蛋白质组的研究离不开分析技术的支撑。由于样品及其基质的复杂性,为了实现蛋白质的高通量、高灵敏度、快速分析鉴定,必须发展与之匹配的新技术与新方法。多维高效液相色谱/毛细管电泳技术,部分弥补了传统2D PAGE的不足,近年来,在蛋白质分离鉴定方面取得了最令人瞩目的成绩。本文分别从多维液相色谱分离技术、多维毛细管电泳蛋白质分离平台、微柱液相-毛细管电泳联用技术、极端pH蛋白质的分离分析和蛋白质的在线富集技术等方面对蛋白质组学研究中在新技术与新方法方面近期取得的成果加以系统阐述。     

金边瑞香有机相提取物库的构建及活性成分分离纯化研究

采用逆流提取-系统溶剂组分化-高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)检测组分化效果-高速逆流色谱技术(High-Speed Counter-Current Chromatography,HSCCC)分离制备高纯度化合物的研究思路,对金边瑞香化学成分进行研究得到4个高纯度单体化合物.通过现代谱学方法分别鉴定为:瑞香素(daphnetin,1)、瑞香黄烷I(daphnodorin I,2)、对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzonic acid,3)和瑞香黄烷D1(daphnodorin D1,4),化合物2～4均为首次从该种植物中分离得到.     

温度对野蚕黑卵蜂寄主利它素的影响

利它素粗提液或涂利它素粗提液的人造卵经不同温度(25℃、60℃或100℃)处理30 min后进行生物活性测定,发现各温度下利它素仍对野蚕黑卵蜂有很强的引诱活性,其平均反应级数与常温(25℃)相比无明显差异,表现出一般蛋白质所没有的热稳定特性。低温 (4℃、0℃、-20℃或-70℃)同样也能保存粗提液中利它素的生物活性,但发现能引起粗提液发生凝集, 且0℃以下比4℃能产生更多的凝集, 使粗提液中利它素活性组分含量减少,-20℃时,其活性组分的峰面积仅为对照的13.1%,表现出一般蛋白质所没有的低温敏感性,这一发现对利它素的快速、简捷、有效分离具有重要的指导意义。     

解淀粉芽孢杆菌Q-426群体感应系统ComX信息素前体肽的合成研究

采用Fmoc固相合成法合成了解淀粉芽孢杆菌Q-426群体感应系统Com X信息素的前体五肽。利用反向半制备色谱(RP-HPLC)和液质联用仪(LC-MS)对合成的五肽进行了分离纯化及纯度分析。建立了检测游离氨基酸的新方法,并详细考察了合成条件对树脂上肽链连接效率的影响。结果表明,新型NNA试剂(茚三酮+正丁醇+乙酸溶液)可替代传统的Kaiser试剂用于Fmoc固相合成中游离氨基的检测;在35℃下,使用DCM和DMF对树脂交替溶胀1h后,树脂上肽链的连接效率最高。合成的Com X信息素前体五肽粗品产率为98%,纯度为58.60%;经半制备型高效液相纯化后,纯度达99%。抑菌实验表明,Com X信息素前体五肽具有明显的生物活性。     

微囊藻毒素降解菌的筛选、鉴定及其胞内粗酶液对藻毒素MCLR的降解

【目的】从巢湖底泥中分离筛选高效的藻毒素降解菌,并初步研究其胞内粗酶液降解藻毒素-LR(MC-LR)的特性,为水体中藻毒素污染的微生物治理提供有效的菌源与理论依据。【方法】利用富集驯化培养技术,以MC-LR为唯一碳源,分离筛选MC-LR降解菌,通过形态观察、生理生化实验及16S rRNA序列分析鉴定菌株,并考察其胞内粗酶液在不同条件下对MC-LR的降解特性。【结果】分离得到1株能高效降解MC-LR的菌株M6。分子鉴定结果表明,该菌株为蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)。其降解MC-LR的活性物质为胞内酶,而且至少有3种酶参与了MC-LR的降解,它们是菌体本身的组织酶而非诱导酶。当反应体系pH值为8.0,胞内粗酶液浓度为404.9 mg/L,MC-LR的初始浓度为10 mg/L时降解率最高,16 h可达98.7%。【结论】分离出的MC-LR降解菌为蜡状芽胞杆菌,该菌株对MC-LR有较高的降解能力,并且酶促反应受到反应体系的pH值、胞内粗酶液浓度以及藻毒素初始浓度等因素的影响。     

血浆中氨基酸检测技术探讨

在血浆中检测游离氨基酸含量是临床诊断的重要手段之一。本文讨论了液相色谱法、氨基酸分析法、液质联用技术等几种血浆中氨基酸的检测技术,并介绍这些技术在氨基酸检测中的应用,为建立血浆中游离氨基酸的分析方法提供参考依据。     

高效毛细管电泳在蛋白质分析上的应用

高效毛细管电泳（ＨＰＣＥ）是继高效液相色谱技术之后的又一新型分析及分离技术,本文应用高效毛细管电泳技术对基因工程干扰素、疫苗、动物脏器提取物等蛋白质产品进行了分离分析和纯度鉴定,并与凝胶电泳的分析结果进行对比。实验结果表明,ＨＰＣＥ可以用于生物产品分离、生物遗传研究和医学临床等领域的蛋白质定量分析、组分测定和纯度鉴定,是一种很有应用前途的新技术。     

高效毛细管电泳在蛋白质分析上的应用

高效毛细管电泳（ＨＰＣＥ）是继高效液相色谱技术之后的又一新型分析及分离技术。本文应用高效毛细管电泳技术对基因工程干扰素、疫苗、动物脏器提取物等蛋白质产品进行了分离分析和纯度鉴定,并与凝胶电泳的分析结果进行对比。实验结果表明,ＨＰＣＥ可以用于生物产品分离、生物遗传研究和医学临床等领域的蛋白质定量分析、组分测定和纯度鉴定,是一种很有应用前途的新技术。     

牦牛骨抗氧化肽的分离纯化及鉴定

为了分离纯化及鉴定牦牛骨胶原多肽,以得到具有DPPH自由基清除率的抗氧化肽。合成抗氧化肽,验证其对DPPH自由基清除率。牦牛骨胶原多肽经陶瓷羟基磷灰石柱层析和C18反相高效液相色谱层析后得到组分F11。当其质量浓度为1 mg/mL时,对DPPH自由基清除率为34.45%。用反相高效液相色谱-质谱联用对F11组分进行序列测定,得到氨基酸序列为GPAGPPGPIGNVGAPGPK和GKSGDRGETGPAGP AGPIGPVGAR的抗氧化肽,分子量分别为1 570.810 3 Da和2 160.104 Da。合成抗氧化多肽GPAGPPGPIGN VGAPGPK和GKSGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR,当其质量浓度为1 mg/mL时,对DPPH自由基清除率分别为16.59%和35.17%。本研究分离鉴定出牦牛骨抗氧化肽,牦牛骨可能成为一种潜在的抗氧化剂。     

香港海藻网胰藻中抗病毒活性多糖的分离与纯化

采用生物活性追踪的方法从香港海藻网胰藻(Hydroclathrus clathratus)中分离具有抗病毒活性的多糖, 其中H3-a1和H3-b1纯度较高, 它们表现出很强的抗单纯疱疹病毒Ⅱ型活性, 且细胞毒性很小. 通过高压液相色谱(HPLC)、紫外扫描、气相色谱、红外分光光谱和元素分析等方法对这2种多糖进行鉴定, 发现它们是2种由不同单糖成分组成的高分子量硫酸多糖, 分别含有一定量的蛋白质和糖醛酸. 同时, 从网胰藻水提物中分离到的多糖显示较低的抗凝血活性. 在分离纯化过程中, 多糖的抗病毒活性随着硫酸基含量的变化而变化.     

海洋细菌Pseudomonas putida中具有抗硅藻附着的活性成分

【目的】为发现天然的防污损物质,从分离自海绵Haliclona sp.的细菌Pseudomonas putida中寻找具有抗硅藻附着活性的化合物。【方法】综合菌落生长形态、扫描电镜及16S rDNA序列分析,鉴定细菌种属;采用活性(抗硅藻附着)-化学(薄层色谱、二极管阵列高效液相和核磁共振氢谱)导向法对其中的活性组分进行分离纯化,波谱分析确定结构;采用抗硅藻附着活性模型对单体化合物进行活性复筛。【结果】该细菌鉴定为Pseudomonas putida;从其发酵液中分离得到6个环二肽,分别鉴定为环(亮氨酸-脯氨酸)(1)、环(亮氨酸-丙氨酸)(2)、环(苯丙氨酸-丙氨酸)(3)、环(缬氨酸-酪氨酸)(4)、环(丙氨酸-酪氨酸)(5)、环(丙氨酸-色氨酸)(6);化合物3和6在浓度为50μg/mL时具有明显的抑制硅藻附着活性(抑制率分别为50%和85%)。【结论】海洋细菌Pseudomonas putida中具有抗硅藻附着的活性化合物为环(苯丙氨酸-丙氨酸)和环(丙氨酸-色氨酸)。