利用半补齐技术构建以质粒为载体的基因文库

在以质粒为载体的基因文库构建中,引入末端半补齐技术,可以显著提高文库转化子中重组子所占的比例(＞70%),从而可以大大减轻文库构建和筛选的工作量.与常用的碱性磷酸酯酶法相比,半补齐技术具有连接产物转化率高、能防止外源片段自身间发生连接反应等优点,可望在以质粒为载体的基因文库构建中取代碱性磷酸酯酶法.     

用羟基磷灰石柱分级洗脱法纯化小牛胸腺末端脱氧核苷酸转移酶和DNA聚合酶

DNA分子体外重组一般有两种方法。一种是限制性核酸内切酶—DNA连接酶方法此法缺点是要求克隆的DNA和载体DNA都必须具有粘性末端,如无粘性末端,必须加大DNA连接酶的酶量才能重组;另一种方法为末端转移酶法,其优点是任意的两种DNA     

多能硫杆菌基因文库的构建以及Rubis CO基因的筛选

以pUC9质粒DNA作为载体,用PstⅠ酶切、碱性磷酸酯酶处理后,与PstⅠ部分酶切的多能硫杆菌染色体DNA3－10kbDNA片段连接,转化大肠杆菌JM83,在MacConkey培养基上筛选重组于,所得的重组子为6.5×10³,达到建库要求的理论值。进一步用光合细菌Rhodobactersphaeroides类型Ⅱ磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶基因（rbcL－rbcS）为探针,从该库中筛选到了含有多能硫杆菌的1,5－二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（RubisCO）基因片段的重组子     

抗HBsAg-碱性磷酸酶双功能抗体分子的构建

为构建带有碱性磷酸酶活性的双功能基因工程抗体, 用PCR方法克隆大肠杆菌碱性磷酸酶基因, 通过酶切分析和DNA序列测定核实后,将其重组到抗乙肝表面抗原(HBsAg) Fab段的Fd羧基端,构建重组融合蛋白表达载体pHBFAP, 转化大肠杆菌XL1-Blue, 经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达后, 采用ELISA法检测到培养上清中存在与HBsAg的结合活性和碱性磷酸酶的催化活性, 显示抗HBsAg-碱性磷酸酶双功能抗体分子在大肠杆菌中获得了表达.     

一种在消除限制酶切点的实验中有效的富集方法

在基因工程的载体构建过程中,常常要遇 到需要消除某些多余的限制酶切点的操作。如 果要消除两个同种限制酶切点中的一个,通常 采用步骤如下：酶切DNA样品、分离部分酶 切后的DNA片段、用DNA聚合酶I Klenow 片段填平切口的粘性末端、再以T4连接酶进行 环化连接、最后进行转化、对转化子进行质粒 DN     

植物中转基因的整合机制

转基因在植物基因组中的整合分两步:在整合前阶段,转化的完整质粒及转基因片段经重组连接形成转基因串联子(transgenearray),其中不含任何植物基因组序列,连接反应由植物细胞本身的酶催化,仅依赖于游离的DNA末端,CaMV35S启动子和TDNA边界序列中的特定序列可能充当重组热点;在整合阶段,转基因DNA通过微同源介导的异常重组整合到植物基因组中,最初的整合位点作为整合热点,引导随后的转基因分子在该位点附近整合,不同转基因位点可被1～10kb植物DNA隔开,形成转基因簇(transgenecluster)。     

植酸酶基因中稀有密码子的改造提高其在毕赤酵母中的表达量

对来源于黑曲霉N2 5(AspergillusnigerChinaStrain)的植酸酶基因phyA进行PCR介导的定点突变 ,不改变其所编码氨基酸 ,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因保守序列中第 81位和第 85位的Arg密码子进行同义突变 .构建了含正确突变的克隆载体pUC18 phyAm 和酵母表达载体pPIC9k phyAm,电击转化毕赤酵母 ,经MM、MD平板筛选和产物的酶活性测定 ,筛选出突变与未突变高酶活酵母转化子各 2株 .这 4株转化子的Southern印迹结果表明 ,phyA基因以单交换方式单拷贝整合到酵母染色体DNA中 .表达产物的SDS PAGE分析表明 ,重组酵母中的植酸酶能有效分泌和表达 ,蛋白质分子大小为 70 15kD .转化子酶活测定结果表明 ,经密码子优化的突变重组酵母酶活力明显高于未进行优化的重组酵母转化子 .经密码子优化的突变重组酵母株PP NPm 8于麦芽汁培养基中诱导 36h后酶活力可达 4 76 0 0U/ml,其活力比未优化重组酵母株PP NP 2 (2 36 6 7U/ml)提高了约 1倍 ,且重组转化子遗传稳定性良好 .     

微紫青霉CBHI酶的CBD蛋白编码区在大肠杆菌中的亚克隆及表达

对插入质粒pUC18－181上的微紫青霉（Penicilliumjanthinellum）CBHI酶的cDNA基因进行一系列DNA体外操作,包括进行序列定向缺失,最后将两末端修饰为平端后进行连接使质粒环化。用得到的产生序列定向缺失的重组质粒转化大肠杆菌JM109。利用CBD能吸附到结晶纤维素上的特性,从随机选取的24个缺失转化子中筛选到一株含CBD编码区的转化子JM109（pUC18C）,所表达的CBD融合蛋白分子量为21kD．JM109（pUC18C）所产生的LacZ-CBD融合蛋白可通过对纤维素的吸附-解吸附过程一步纯化。其IPTG诱导的pNPC酶活力为零,表明该菌已不再具有CBHI酶活力。     

麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因的研究

将麦迪霉素产生菌基因文库中与放线紫红索酮基还原酶基因actⅢ有同源性的4·0kb DNA片段克隆到质粒载体pWHM3中,构成重组质粒pCB4。将质粒pCB4转入酮基还原酶基因缺陷菌株——加利利链霉菌ATCC3167l中,得到转化子。转化子发酵产物经TLC和HPLC分析证明是阿克拉菌酮,与加利利链霉菌原株ATCC31133的产物相同,说明麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因互补了加利利链霉菌ATCC31671中缺陷的酮基还原酶基因,使其恢复了产生阿克拉菌酮的能力。4．Okb DNA片段插入方向相反的重组质粒pCBR4在加利利链霉菌ATCC31671中发酵产物经TLC分析证明也是阿克拉菌酮,这说明4．0kbDNA片段中麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因具有自身的启动子。对4．0kb DNA片段进行了限制酶酶切分析,建立了其酶切图谱。以actⅢ基因为探针,经分子杂交以及亚克隆和DNA转化实验,将麦迪霉索产生菌酮基还原酶基因定位于BssH Ⅱ—BamH Ⅰ 1．3kb DNA片段上。对1．3kb DNA片段核苷酸序列分析结果表明：此1．3kbDNA片段中含有一个独立的ORF,起始密码ATG,终止密码TAG,含783bp;在起始密码上游有GGAGG5个核苷酸SD序列;此ORF编码260个氨基酸,与actⅢ基因编码的261个氨基酸相似性为77．4%,相同性为66．7％,对麦迪霉素产生苗酮基还原酶基因的可能作用进行了讨论。     

用无细胞克隆系统进行特异DNA扩增的技术—PCR

作为分子生物学基石之一的分子克隆技术,是一系列技术的总称,包括目的基因的提纯,选择有自主复制能力的载体DNA,选用不同的限制性内切酶,构建新的重组DNA,导入受体细胞,重组DNA的转化,转化后遗传物质和性状的转移及重新组合,重组DNA的纯化扩增等。该系列技术的操作相当复杂繁琐且耗时长。如何从极微量的生物材料中简便快速地得到大量特定的基因,或是在众多复杂的生物基因DNA中,     

乙型肝炎病毒adw亚型基因组在大肠杆菌中的克隆

从乙型adw亚型肝炎慢性患者的血浆中,分离纯化了乙型肝炎病毒(HBV)DNA,将HBVDNA以ECOR I酶切,与经ECOR I酶切、磷酸单脂酶处理的pBR325质粒DNA相连接,转化至大肠杆菌RR_1菌株。经筛选鉴定,转化子中有45株含有完整的HBV基因组DNA,应用限制内切酶分析,表明其位点与已报道的adw亚型有很大的不同。     

酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子片段的亚克隆

含有3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的酿酒酵母染色体3.1kb HindⅢ片段,已被克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭载体pCN60上。Kpn Ⅰ核酸内切酶在pCN60上没有酶切位点,而在pCN60(PGK1)上仅有一酶切位点。用此酶将pCN60(PGK1)质粒完全酶切,再用Bal31从两端逐步消解碱基对,使反应终止于每端消解500bp左右,加上EcoR Ⅰlinker。用EcoRⅠ、BamH Ⅰ酶切,分离1. 9kb的DNA片段,插入用同样双酶切的酵母启动子探针载体pVC727上,转化E.coli C600,再从转化子中提取重组质粒转化酵母受体菌NA87-11A。用菌落染色法筛选出PHO5基因高效表达转化子,这个转化子质粒含有1.9kb的BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切片段,它具有强启动子功能,并测定其3'末端序列。     

绿色木霉纤维素酶CBHII基因的分子克隆

本文以噬菌体lambda EMBL3 DNA为载体,通过克隆绿色木酶(Trichoderma viride)高分子量基因组DNA的部分酶解片段,并将重组分子进行体外包装后侵染Escherichia.coli K802,由此构建了绿色木霉基因文库。以李氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶CBHII基因的末端片段为探针,用轮迥噬菌斑原位杂交从文库中筛选出CBHII基因的阳性克隆5个,随机取其中3个克隆用上述探针作斑点杂交,结果进一步证明克隆了全长或近全长的绿色木霉CBHII基因,用李氏木霉CBHI基因的末端片段探针作斑点杂交,结果提示CBHI与CBHII基因的末端序列之间无同源性存在。从斑点杂交的阳性克隆中提取DNA,酶切鉴定插入片段的长度,并克隆于质粒pUC19,Southern杂交结果证明获得了含绿色木霉CBHII基因的重组质粒pCBHII-14。     

酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子片段的亚克隆

含有3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的酿酒酵母染色体3.1kb HindⅢ片段,已被克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭载体pCN60上。Kpn Ⅰ核酸内切酶在pCN60上没有酶切位点,而在pCN60(PGK1)上仅有一酶切位点。用此酶将pCN60(PGK1)质粒完全酶切,再用Bal31从两端逐步消解碱基对,使反应终止于每端消解500bp左右,加上EcoR Ⅰlinker。用EcoRⅠ、BamH Ⅰ酶切,分离1. 9kb的DNA片段,插入用同样双酶切的酵母启动子探针载体pVC727上,转化E.coli C600,再从转化子中提取重组质粒转化酵母受体菌NA87-11A。用菌落染色法筛选出PHO5基因高效表达转化子,这个转化子质粒含有1.9kb的BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切片段,它具有强启动子功能,并测定其3'末端序列。     

α-互补与蓝白斑筛选机制的探究

针对高校生物科学实验教学中存在的问题,着重探究了基因重组试验中的α-互补与蓝白斑筛选机制,精心设计了5组试验,结果指出,经双酶切的质粒载体自身不能环化,也不能成功转化;蓝白斑筛选中的蓝斑通常来源于商品载体中的环状质粒或者线性载体自连后的转化产物;重组子一般为白斑,但在一定条件下,白斑也会变成蓝斑。在此基础上作了进一步的讨论,为今后的教学实践和科学研究提供借鉴和指导。     

水稻线粒体26S rRNA基因在大肠杆菌JM101中的克隆及分子鉴定

用BT型水稻喜峰A黄化苗为材料,按本实验过去报道经修改后的方法提取线粒体DNA,经EcoR1完全酶切后,随机克隆到pUC19载体上,转化大肠杆菌,在含氨苄青霉素(50μg/m1)和X-gal的LB固体平板上筛选白色转化子。随机提取重组子DNA,以玉米26S rRNA基因为探针,经Southern分子杂交鉴定,一个插入1.3kb水稻线粒体DNA片段的重组质粒杂交结果为阳性,并将这个含有26S rRNA基因片段的重组质粒命名为pXMT1。     

一种cDNA克隆的简易方法

构建了一种适用于克隆cDNA的双分子质粒载体。使用此载体,以载体引物合成ds-cDNA后,用连接酶将cDNA-载体重组子自身环化,转化宿主菌。本文以此方法构建了人胚胎组织cDNA文库,转化菌中约50％含有cDNA插入片段。此方法大大简化了cDNA克隆步骤,提高了克隆效率。     

植酸酶基因的多点突变及在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母基因的密码子选择偏爱性,不改变其编码氨基酸序列,对来源于黑曲霉N25植酸酶phyA基因,进行了突变,构建了含有正确突变的酵母表达载体pPIC9k-phyAm-4,电击转化毕赤酵母,获得优化了密码子的重组酵母转化子。经PCR鉴定表明,植酸酶基因已整合到酵母基因组中; 表达产物的SDS-PAGE分析表明,酶蛋白分子大小为70.15KD。Southern blotting结果表明,phyA基因整合到酵母染色体DNA中;转化子酶活测定结果表明,经密码子优化的重组酵母PP-NPm-4-2酶活可达136900U/ml,比Arg没有优化的PP-NPm-8 (47600 Uoml-1)酶活高约2.8倍。     

限制性内切酶Bam HI的制备

限制性内切酶是DNA体外重组极其重要的工具。Bam HI是使用最多的一种工具酶。它识别碱基的序列为:5′G↓GATTC3′。对质粒_PBR322_PBR317等只有一个酶切位点,同时它恰好切在质粒_PBR322的抗四环素基因上,所以使受体菌失去抗四环素的能力,因此,用这种质粒作DNA体外重组的载体,则便于筛选重组子。目前,Bam HI除广泛用于DNA的体外重组外,还用于DNA的限制性酶切图,DNA     

人骨形态发生蛋白2(BMP-2)在巴斯德毕赤酵母中的表达

以重组质粒pUC-BMP2为模板PCR扩增人BMP-2成熟肽编码序列,将该序列克隆入pGEM-T载体进行DNA序列分析后亚克隆入分泌型毕赤酵母表达载体pPIC9K中。重组质粒oPIC9K-BMP2经BelⅡ酶切后回收线性化片段,聚乙二醇法转染毕赤酵母茵株GS115。PCR筛选整合有人BMP-2基因的酵母细胞重组子,以甲醇进行诱导表达,于酵母细胞培养基中可检测到rhBMP-2。体外培养条件下,所得rhBMP-2可增加2T3小鼠成骨细胞内碱性磷酸酶活性;体内实验．rhBMP-2冻干粉可于小鼠骨四头肌肌袋中诱导软骨细胞群产生。