稳定转染MiR-499对P19CL6细胞向心肌细胞分化的影响

小鼠miR-499基因包含在心肌重链肌球蛋白Myh7b基因的第19内含子中,并且在心肌细胞中特异表达,然而其在心肌细胞中表达的生物学功能和意义尚不清楚.利用可体外分化为心肌细胞的P19CL6细胞建立稳定表达miR-499的细胞株对研究miR-499的生物学功能具有重要意义.根据小鼠miR-499基因序列,设计PCR引物...     

心肌分化过程中经典Wnt信号促进Isl1表达北大核心CSCD

ISL1是第二生心区的分子标志,在心血管发育中发挥重要作用.在心脏发育过程中,Isl1的表达具有鲜明的时空特异性.本研究利用P19CL6畸胎瘤干细胞作为心肌分化模型,探讨了Isl1在心肌诱导分化过程中的时间特异性表达及经典Wnt信号通路对其的调控.研究发现,Isl1在心肌分化早期高表达,于诱导第4 d到达高峰,随后快速下调.其表达趋势与经典Wnt通路的激活模式具有时间上的同步性.通过加入Wnt3a蛋白及Li Cl激活经典Wnt通路,能够促进Isl1基因的表达,而Wnt通路抑制分子Frizzled-4/Fc和DKK1能够下调Isl1表达.β-catenin过表达及RNAi实验也获得相似的结果.染色质免疫共沉淀实验证实,Wnt通路效应分子LEF1,在细胞分化第4 d与其在Isl1基因启动子上游-2 300 bp处的结合增强,因而促进了Isl1基因的表达.本研究表明,经典Wnt信号能够通过LEF1/β-catenin与Isl1启动子特异结合,调控Isl1基因在心肌早期分化阶段的表达.     

心肌分化过程中经典Wnt信号促进Isl1表达

ISL1是第二生心区的分子标志,在心血管发育中发挥重要作用.在心脏发育过程中,Isl1的表达具有鲜明的时空特异性.本研究利用P19CL6畸胎瘤干细胞作为心肌分化模型,探讨了Isl1在心肌诱导分化过程中的时间特异性表达及经典Wnt信号通路对其的调控.研究发现,Isl1在心肌分化早期高表达,于诱导第4 d到达高峰,随后快速下调.其表达趋势与经典Wnt通路的激活模式具有时间上的同步性.通过加入Wnt3a蛋白及Li Cl激活经典Wnt通路,能够促进Isl1基因的表达,而Wnt通路抑制分子Frizzled-4/Fc和DKK1能够下调Isl1表达.β-catenin过表达及RNAi实验也获得相似的结果.染色质免疫共沉淀实验证实,Wnt通路效应分子LEF1,在细胞分化第4 d与其在Isl1基因启动子上游-2 300 bp处的结合增强,因而促进了Isl1基因的表达.本研究表明,经典Wnt信号能够通过LEF1/β-catenin与Isl1启动子特异结合,调控Isl1基因在心肌早期分化阶段的表达.     

抑制NHE1活性对干细胞向心肌分化的影响

Na /H 交换蛋白1(NHE1)在心肌细胞发育过程中发挥重要的调节功能.为深入探索NHEl活性对干细胞向心肌分化过程中产生的影响,采用二甲基亚砜(DMSO)诱导P19干细胞向心肌细胞分化,同时在培养液中添加NHE1抑制荆EMD87580,对诱导后形成的类胚体进行检测.通过细胞形态观察、免疫组织化学染色及检测心肌特异表达基因等方法证明,经诱导形成的类胚体贴壁生长后,会向心肌细胞分化并出现跳动细胞团.而经过抑制剂处理的P19干细胞尽管能够形成类胚体且贴壁培养后细胞仍具有增殖活力,细胞团周边也较整齐,但未出现向心肌细胞分化的现象.这一结果表明,抑制NHE1的活性,能够影响P19干细胞向心肌细胞的分化作用.     

Lrrc10在体外心肌发生过程中的表达研究

Lrrc10是一心脏特异新基因.为探讨Lrrc10在心肌细胞分化过程中的表达,采用DMSO诱导P19细胞分化,建立体外心肌发生模型,显微镜观察细胞形态变化,以心α-MHC和β-MHC作为心肌分化的标志,RT-PCR检测分化过程中各基因的表达.结果 表明,P19细胞经诱导后形态发生明显变化;α-MHC在诱导分化6 d时开始表达,β-MHC在诱导分化8 d时开始表达,表明心肌分化成功.而Lrrc10在诱导分化2 d时就开始表达,提示其功能可能与心肌分化有关.     

ISL1与PHF8相互作用促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化

近年的研究发现,在心肌细胞分化过程中,转录因子可以与表观修饰蛋白质结合进行更为精细的转录调控.作为转录因子的胰岛素基因增强子结合蛋白1（islet1, ISL1）,在心血管发育过程中发挥至关重要的作用.然而, ISL1是否能够与表观修饰蛋白质相互作用,从而发挥更为精细的调控作用,目前尚未明确.本室研究发现,ISL1在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中,能够与组蛋白去甲基化酶PHD指蛋白8(PHF8)相互作用从而促进分化. 实时RT-PCR和Western 印迹的方法检测显示,ES细胞向心肌细胞分化过程中ISL1和PHF8具有相似的表达谱.通过免疫共沉淀的方法检测分化过程中ISL1与PHF8的结合,通过染色质免疫沉淀的方法对二者在ISL1下游靶基因增强子区的结合水平进行检测,利用实时RT-PCR检测二者的相互结合对心肌细胞分化的影响.结果显示,ISL1能够与PHF8相互作用,共同结合在ISL1下游靶基因Mef2c和Myocd的增强子区,协同促进ES细胞向心肌细胞的分化.本研究证实,在心肌细胞分化过程中,ISL1存在与表观修饰蛋白质PHF8的相互作用,从而进一步促进心肌细胞的分化.     

ISL1与PHF8相互作用促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

近年的研究发现,在心肌细胞分化过程中,转录因子可以与表观修饰蛋白质结合进行更为精细的转录调控.作为转录因子的胰岛素基因增强子结合蛋白1(islet1,ISL1),在心血管发育过程中发挥至关重要的作用.然而,ISL1是否能够与表观修饰蛋白质相互作用,从而发挥更为精细的调控作用,目前尚未明确.本室研究发现,ISL1在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中,能够与组蛋白去甲基化酶PHD指蛋白8(PHF8)相互作用从而促进分化.实时RT-PCR和Western印迹的方法检测显示,ES细胞向心肌细胞分化过程中ISL1和PHF8具有相似的表达谱.通过免疫共沉淀的方法检测分化过程中ISL1与PHF8的结合,通过染色质免疫沉淀的方法对二者在ISL1下游靶基因增强子区的结合水平进行检测,利用实时RT-PCR检测二者的相互结合对心肌细胞分化的影响.结果显示,ISL1能够与PHF8相互作用,共同结合在ISL1下游靶基因Mef2c和Myocd的增强子区,协同促进ES细胞向心肌细胞的分化.本研究证实,在心肌细胞分化过程中,ISL1存在与表观修饰蛋白质PHF8的相互作用,从而进一步促进心肌细胞的分化.     

hhlim对心肌肥大的影响及其作用机制探讨

hhlim是从胎儿心脏中新近分离和克隆得到的与心脏发生相关的基因,其表达产物作为转录因子参与多种基因的转录调控和细胞的发育与分化过程.用细胞转染方法将外源性hhlim基因导入原代心肌细胞,发现该基因强制性表达可使心肌细胞体积明显增大.RT-PCR和蛋白质印迹结果表明,hhlim促心肌细胞肥大与诱导α-肌动蛋白(α-actin)过表达及重新启动胚胎期表达基因脑钠肽（BNP）表达有关.用可表达hhlim反义RNA的真核表达载体转染心肌细胞后,致心肌细胞肥大因子ET-1对BNP和α-actin表达的诱导受到显著抑制.这些结果表明,ET-1促进BNP和α-actin表达及引发心肌肥大的效应可能由hhlim所介导,提示hhlim表达与心肌细胞肥大的启动有关.单独或共转染转录因子hhlim、Nkx2.5、GATA-4表达质粒和BNP转录调控区指导的报告基因结果显示,hhlim强制性表达不仅能直接激活BNP基因表达,而且与NKx2.5具有协同作用.结果表明,hhlim可以通过直接或与Nkx2.5协同作用激活BNP基因的表达.     

KLHL31促进C2C12细胞的肌原分化

人类KLHL31基因是本实验室已克隆的基因,其蛋白质含有保守的BTB和串连重复的Kelch结构域,已有报道表明其在人类成体骨骼肌和心肌组织中特异表达。RT-PCR分析表明在C2C12细胞肌原分化过程中过表达KLHL31能够提高肌原分化标志基因MyoD与Myogenin的转录水平;荧光报告系统分析发现过表达KLHL31能够增强肌原分化相关基因MCK启动子的活性,表明KLHL31能够促进C2C12细胞的肌原分化。     

MLP参与心肌肥大发生过程与Calcineurin/NFAT信号通路有关

心肌肥大是心肌细胞面对多种病理刺激时的共同反应,以心肌细胞体积增大和胚胎期基因的重新表达为标志.心肌发育调控基因肌肉LIM蛋白(muscle LIM protein,MLP)的表达异常与心肌肥大有关.为研究MLP参与心肌肥大发生的分子机制,采用去氧肾上腺素（phenylephrine, PE）刺激大鼠原代培养心肌细胞,建立心肌细胞肥大模型,采用RNAi技术敲减MLP的表达,分析MLP与肥大信号通路钙调神经磷酸酶（calcineurin）/活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T-cells, NFAT）的关系.结果显示, 原代培养的心肌细胞经一定浓度的PE刺激后细胞表面积增加,肥大标志蛋白ANP、BNP表达增高,并伴有MLP表达上调. RNAi方法敲减MLP的表达则明显抑制PE诱导的心肌细胞表面积增加和BNP表达增高,并且直接 影响NFAT的转录激活活性,提示MLP与心肌肥大的发生密切相关,并且可能是通过calcineurin/NFAT信号通路而参与心肌肥大的发生.     

Expression of metalloproteinases and inhibitors in the differentiation of P19CL6 cells into cardiac myocytes

P19CL6 are a clonal derivative of P19 embryonal carcinoma cells, a euploid, multipotent mouse cell line, that differentiate efficiently into cardiac myocytes, with spontaneous beating evident within 10 days, following DMSO treatment. Using real-time quantitative RT-PCR we have profiled the expression of the complete matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of metalloproteinase gene families during P19CL6 differentiation to cardiac myocytes. The genes subdivide into eight groups based upon their expression profile. Their expression was both qualitatively and quantitatively highly homologous to that seen during mouse heart development.