旋毛虫基因重组抗原的纯化

根据旋毛虫基因重组抗原蛋白的特点,筛选出裂解处理工程菌菌体的方法,并探索了用ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－３００（ＨＲ）柱层析纯化重组蛋白的程序。用本法处理和纯化后,重组蛋白的纯度可达９０％以上。所纯化的三种重组抗原蛋白均能与猪旋毛虫病血清发生特异性反应而不与正常猪血清和猪囊虫病血清反应,其中以重组蛋白ＲＰ３４的特异性最强,ＲＰ３７较弱,ＲＰ４６介于两者之间。研究结果表明,本纯化方法易于操作、设备简单和特异性蛋白回收率高,是处理和纯化旋毛虫基因重组抗原的最佳程序。     

猪水泡病病毒VP1基因的克隆和表达

以猪水泡病病毒RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了849bp的VP1基因,通过T-A克隆技术,将VP1基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,构建SVDVVP1基因克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析。然后亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体,经测序鉴定,筛选获得VP1基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了猪水泡病病毒VP1基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP1蛋白抗原。SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.002%的L-阿拉伯醛糖进行诱导,5h后表达可达到高峰,表达蛋白为融合蛋白,质量约47.13kDa,表达产量约占菌体总蛋白的16%。Westernblotting检测表明,诱导的蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。融合蛋白中含有猪水泡病病毒VP1蛋白抗原,为应用该表达蛋白抗原制备SVD免疫血清学诊断试剂和新型疫苗构建奠定基础。     

斜纹夜蛾核多角体病毒p49基因在大肠杆菌中的表达及其在昆虫细胞中的表达时相分析

利用PCR方法从斜纹夜蛾核多角体病毒（SpltMNPV）基因组中扩增获得了细胞凋亡抑制基因〖STBX〗p49〖STBZ〗的完整ORF并将其克隆于pMD18T载体,其序列分析结果与文献报道一致。将基因重组于硫氧还蛋白融合表达载体pThioHis C,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了稳定表达,表达的P49融合蛋白占菌体总蛋白30%左右,主要以包涵体形式存在。分离纯化重组表达的SpltMNPV P49蛋白作为抗原,免疫家兔制备得到效价高于1∶10000的抗重组P49蛋白多克隆抗体。应用制备的抗体对受SpltMNPV感染的Sl细胞中P49蛋白的表达时相进行分析,结果显示P49蛋白在细胞感染后3h内便可检测到,并在整个感染期间维持着低水平表达。     

猪水泡病病毒VP1基因的克隆和表达

以猪水泡病病毒RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了849bp的VP1基因,通过T-A克隆技术,将VP1基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,构建SVDV VP1基因克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析.然后亚克隆插入pBAD/Thio TOPO表达载体,经测序鉴定,筛选获得VP1基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了猪水泡病病毒VP1基因重组表达载体.经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP1蛋白抗原.SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.002%的L-阿拉伯醛糖进行诱导,5h后表达可达到高峰,表达蛋白为融合蛋白,质量约47.13kDa,表达产量约占菌体总蛋白的16%.Western blotting检测表明,诱导的蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应.融合蛋白中含有猪水泡病病毒VP1蛋白抗原,为应用该表达蛋白抗原制备SVD免疫血清学诊断试剂和新型疫苗构建奠定基础.     

志贺毒素B（ShT-B）亚单位在两种表达载体中表达形式分析

用KpnⅠ和HindⅢ双酶切pGEMTB3克隆质粒,得到大小约为225bp的ShTB基因片段,分别将其插入到经双酶切的pQE40和pQE30表达载体中,构建了2个ShTB的重组表达质粒pQE40B3和pQE30B2,分别转化到E.coliM15,经IPTG诱导后,重组质粒目的蛋白均得到表达。其中,pQE40B3表达蛋白约占菌体总蛋白的37%,主要为包涵体形式。pQE30B2表达蛋白约占菌体总蛋白的16%,主要为可溶性形式,约9.2%。为重组抗原的制备提供了必要的物质基础。     

弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的融合表达、纯化及抗原性分析

利用基因工程技术制备抗原性好的弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的融合蛋白,并用作抗原检测弓形虫抗体。根据弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的氨基酸序列,通过计算机分析,筛选出其中较强的抗原决定簇。用PCR方法分别扩增含抗原决定簇的基因片段。将这两个基因片段克隆至同一质粒pET28a(+)内,表达一个融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选表达该融合蛋白的工程菌。纯化表达的融合蛋白,用已知的6份抗弓形虫IgM阳性血清和大量正常人血清,ELISA法检测纯化融合蛋白的抗原性和特异性。获得了高效表达含弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白抗原表位的工程菌,表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的25%。纯化获得了表达的融合蛋白,该蛋白有较好的抗原性和特异性。表达的弓形虫GRA6和P30融合蛋白可用做抗原检测弓形虫抗体,用于临床及孕妇检测,对优生优育有较大意义。     

人血管生成素-PE40融合蛋白基因的构建、表达及活性研究

利用 PCR扩增出人血管生成素 (h ANG)成熟肽的基因片段 .与绿脓杆菌外毒素缺失突变体PE40的基因连接后 ,克隆入 p UC1 9载体中 .测序后克隆入表达载体 p RSETB,构建成 h ANG-PE40融合基因的表达载体 .IPTG诱导 ,表达出分子量约为 58k D的 His6- ANG- PE40融合蛋白 ,占菌体总蛋白的 8% .Ni2 +- NTA树脂纯化表达蛋白 ,SDS- PAGE结果显示纯化重组蛋白为单一条带 .鸡胚绒毛尿囊膜鉴定表明重组蛋白体外能够有效地抑制血管的形成 .     

黄曲霉细胞壁蛋白AFLMP1的基因克隆与原核表达

根据NCBI数据库中的黄曲霉细胞壁蛋白AFLMP1的基因序列设计特异引物,以黄曲霉菌总RNA逆转录获得的c DNA为模板,PCR扩增目的基因后分别克隆到p GEX-6p-1和p ET-22b原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。重组大肠杆菌经IPTG诱导表达后超声波破碎提取可溶性蛋白,SDS-PAGE电泳和Western杂交检测表达产物,结果表明GST-AFLMP1和AFLMP1-His融合蛋白能够在大肠杆菌中大量可溶性表达,可分别作为制备AFLMP1特异抗体的免疫抗原和筛选抗原。     

中国白兔白介素-10基因的克隆、表达及其抗体的制备

目的克隆并表达中国白兔IL-10基因,制备抗IL-10多克隆抗体。方法运用RT-PCR对从ConA诱导后的中国白兔外周血单核细胞(PMBCr)总RNA中扩增IL-10基因,克隆后进行测序和遗传进化分析,同时将其亚克隆pET28a中,在大肠杆菌中诱导表达,并用纯化的表达产物制备多克隆抗体。结果该基因全长537 bp,编码178个氨基酸。与欧洲兔IL-10基因同源性很高,但与鼠、鸡、河豚和斑马鱼等不同物种IL-10基因差异较大。经IPTG诱导后,重组菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子质量为23.4×103的重组蛋白。Western blot分析表明,中国白兔IL-10基因已经表达。重组表达的蛋白量可占菌体蛋白的15.2%。结论成功实现了中国白兔IL-10的原核表达,制备了小鼠抗兔IL-10的多克隆抗体。     

蓝舌病病毒vp7基因的表达及其产物在c-ELISA中的应用

获得稳定、高效的具有良好抗原性的蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)vp7基因重组抗原.将BTV编码群特异性抗原VP7的S7基因片段克隆至pMD18-T质粒载体中,构建S7克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析.与已报道的多株BTV编码VP7的基因比较后发现,所测定毒株的核苷酸序列与BTV10型的S7基因同源性高达98.7%,推测的氨基酸同源性为99.3%,证实为BTV的S7基因.然后亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体,转化LGM194细胞,经抗性培养、PCR、限制性内切酶分析、测序鉴定,筛选获得BTV S7基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了BTV群特异性抗原VP7的重组表达载体.经L-araboinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP7蛋白抗原.SDS-PAGE、ELISA试验表明,表达蛋白为融合蛋白,具有反应原性,分子量约54.5kD,重组蛋白的获得率为1.52mg/g湿菌,其表达产量约占菌体总蛋白的12%左右,相当于93.5mg/L菌液.融合蛋白中含有BTV VP7特异性蛋白抗原,可作为c-ELISA包被抗原,为蓝舌病的免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础.     

意大利蜜蜂丙糖磷酸异构酶基因的克隆及其原核表达与纯化

从意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的肌肉组织中提取总RNA,采用RT-PCR的方法克隆蜜蜂第16号染色体上的丙糖磷酸异构酶基因的cDNA序列,将测序结果(GenBank登录号EU76098)与推导的氨基酸序列分别与GenBank中的其他物种进行同源比对分析。结果表明,该基因全长744bp,为完整的阅读框,编码247个氨基酸,成熟蛋白的理论分子量为26.89kD。比对结果显示AmTPI与家蚕、德国小镰、黄粉虫、丽蝇蛹集金小蜂、水稻等物种的基因相似性达69%以上,蛋白相似性达59%以上。将目的基因克隆到pGEX-4T-2融合表达载体上,并在大肠杆菌中得到成功表达,4h的表达量为总蛋白的42.1%。为了进一步探讨产物的酶学特性,实验还对表达产物进行纯化与浓缩。实验还构建增强型荧光真核表达质粒,为进一步研究AmTPI在真核细胞中的表达情况奠定基础。     

日本血吸虫(中国大陆株)谷胱甘肽转移酶编码区基因的体外扩增、克隆及在原核细胞的高效表达

为表达、获取日本血吸早谷胱甘肽转移酶（ＳｊＧＳＴ）基因工程重组蛋白,以日本血吸虫（中国大陆株）ｃＤＮＡ为模板,设计、合成特定寡核苷酸引物,ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＧＳＴ编码基因序列,将扩增产物连接ｐＧＥＭ－Ｔ克隆载体,再亚克隆到真、原核表达质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ中,转染大肠杆菌ＸＬ１－ｂｌｕｅ,经ＩＰＴＧ诱导后用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表达效果。结果 ＲＴ－ＰＣＲ法特异性扩增出日本血吸虫ＧＳＴ编码区基因片段,其     

易于基因产物加工和快速纯化的融合表达载体

从Protein A基因酶切分离出编码完整的结合IgG的B、C区域(PABC)的相应DNA片段,克隆进噬菌体M1乳通过人工合成寡聚核苷酸引物,突变修饰B、C区域内分别含有的羟胺裂解位点,变As-Gly为Asn—A1a。利用突变修饰后的PBACm编码基因片段,构建了一组含有不同阅读框架的融合蛋白表达载体。进一步分别重组克隆了含人工合成的人胰岛索样生长因子Ⅰ(IGF—Ⅰ)、人和牛生长激素释放因子(GRF)等基因的表达质粒,在大肠杆菌中高效表达出PABC—IGF—l、PABC—hGRF、PABC-bGRF及其衍生型融合蛋白。经SDS—PAGE测定分析,每立升摇瓶的融合蛋白产量可达100mg以上。上述高效表达的PABC融合蛋白,通过固相亲和层析柱一步分离．获得SDS—PAGE鉴定为近均一分子量纯化的PABC融合表达产物。     

RT－cDNA克隆－PCR法获取犬瘟热病毒融合蛋白基因（F）

纯化鸡胚成纤维细胞培养的犬瘟热病毒（ＣａｎｉｎｅＤｉｓｔｅｍｐｅｒＶｉｒｕｓ,ＣＤＶ）,获得病毒基因组ＲＮＡ后,反转录合成双链病毒Ｆ基因ｃＤＮＡ。将此双链ｃＤＮＡ平端插入ＰＵＣ１９质粒ＳａｍⅠ位点构建重组质粒,进行ｃＤＮＡ克隆。以重组克隆质粒为模板ＰＣＲ扩增,获得ＣＤＶ全长Ｆ基因。将此Ｆ基因插入表达载体ＰＢＶ２２０,在大肠杆菌中表达,通过对表达产物的最终鉴定,可确认所获片段为ＣＤＶ全长Ｆ基因．     

凋亡抑制因子Survivin在大肠杆菌TB1中的表达纯化及鉴定

 本文旨在克隆凋亡抑制因子Survivin基因,并在大肠杆菌中进行可溶性表达与初步纯化. 采用RT-PCR法,扩增人凋亡抑制因子survivin cDNA,并克隆入原核表达载体pMAL p2X中,转化TB1大肠杆菌感受态细胞.经0.3 mmol/L IPTG诱导2 h后,收集菌体蛋白,进行SDS-PAGE、ELISA及Western 印迹鉴定. 实验获得凋亡抑制因子survivin编码区cDNA,以构建的原核表达载体pMAL-p2X survivin转化菌株后,可表达凋亡抑制因子survivin和麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白,相对分子质量(Mr) 为58 000.并成功利用Factor Xa将融合蛋白裂解开.ELISA和Western 印迹表明,融合蛋白能与抗凋亡抑制因子survivin单克隆抗体特异性结合.获得的凋亡抑制因子survivin全长cDNA可在大肠杆菌TB1中以MBP survivin融合蛋白的形式表达,成功地将survivin目的蛋白和MBP蛋白分离,为深入研究survivin的结构和功能奠定了基础.     

Angioarrestin(hARPl)C端FD区的克隆、表达及其免疫活性鉴定

 Angioarrestin是一种具有潜在应用价值的肿瘤血管形成抑制因子.利用DNA重组法构建了angioarrestin C端 hFD cDNA 和麦芽糖结合蛋白(MBP)重组原核表达质粒 pMAL-C2-hFD.将重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）,经0.3 mmol/LIPTG 在37℃条件下诱导表达4h,SDS-PAGE 检测,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的20%.Western印迹证实,目的蛋白N端带有MBP标签.取表达上清纯化、透析、浓缩并冻干,以此为抗原免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体.此多抗可以与pET 22b（+）表达系统获得的 hFD重组蛋白发生良好的抗原抗体反应,ELISA检测多抗效价达1∶10240.实验证明：通过基因重组可获得angioarrestin C端hFD在大肠杆菌中的高效表达蛋白,且该蛋白具有较高的免疫活性.以此为抗原制备的抗angioarrestin多克隆抗体为深入研究angioarrestin提供了材料.     

猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原AN端保护区在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A（SpaA）N端保护区（SpaA-N）,并检测其抗原性。方法：利用PCR方法从猪丹毒丝菌C43065株基因组中扩增出spaA基因片段,构建pMD18-spaA重组质粒并对插入片段进行测序;以pMD18-spaA重组质粒为模板,PCR扩增得到spaA-N基因片段,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）,再经IPTG诱导表达GST-SpaA-N融合蛋白并纯化。结果：扩增得到的spaA基因长1881bp,编码由626个氨基酸残基构成的多肽;SDS-PAGE和Western印迹检测结果表明,诱导表达获得相对分子质量约64000的GST-SpaA-N融合蛋白,该融合蛋白能与相应抗体发生特异性反应。结论：获得了在大肠杆菌中可溶性表达的GST-SpaA-N融合蛋白,为进一步研究猪丹毒丝菌免疫保护性抗原奠定了基础。     

猪2型圆环病毒原核表达产物的免疫原性测定

目的检测猪2型圆环病毒(PCV2)全基因组原核表达产物的免疫原性。方法根据PCV2JXL株序列(GenBank登录号AY491310),设计合成引物,利用多聚酶链式反应(PCR)从含有PCV2接种猪肾细胞PK15中扩增了Cap蛋白的氨基端片段(737-421nt),克隆入上游带有谷光苷肽-S-转移酶的原核表达载体pGEX-6p-1中,获得重组质粒pGEX-PCV737-421。PCV2Cap蛋白羧基端(426-37nt)和Rep蛋白已在过去的研究中分别融合表达。利用IPTG对3种重组大肠杆菌BL21进行诱导,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)以及对PCV2阳性猪多抗血清的蛋白免疫印迹试验,在此基础上,将3种SDS-PAGE分离粗纯的重组表达产物碾碎后分别免疫BALB/c小鼠,用获得的抗鼠血清与PCV2病毒感染PK15细胞做间接免疫荧光抗体试验(IFA)。结果PCV2Cap蛋白的氨基端片段能在大肠杆菌中表达,且Cap蛋白羧基端和Rep蛋白的原核表达产物都能在免疫印迹试验中被PCV2阳性猪血清检测出特异性条带,重组蛋白免疫鼠血清可在IFA试验中观察到特异性的荧光分布,即检测到培养细胞中的病毒抗原。结论PCV2全基因组都可以用原核系统高效表达,且表达产物具有免疫原性。     

在大肠杆菌中高效表达人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)核心蛋白

将编码人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)核心蛋白(Gag)P24的大部分基因片段,插入大肠杆菌表达载体pEX31A中,获得的表达产物MS2-Gag融合蛋白占菌体总蛋白的20％左右。Western blot结果证明,这种表达产物能被艾滋病(AIDS)患者血清中的特异性抗体所识别。这是国内首次报道在大肠杆菌中高效表达人类免疫缺陷病毒Ⅰ型核心蛋白。对表达的重组核心蛋白的意义及应用前景进行了讨论。     

可溶性HLA-A*0203-BSP原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建HLA-A*0203重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的融合蛋白（HLA-A*0203-BSP）的原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA-A2+ 供者外周血单个核细胞(PBMC)中克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA并测序鉴定,然后以PCR方法构建HLA-A*0203-BSP的原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达并以免疫印迹鉴定。结果：DNA测序显示,从3名HLA-A2+ 供者PBMC中克隆的cDNA中,只有从供者2获得编码HLA-A*0203重链基因的cDNA。将编码重链胞外域1-276的序列和编码BSP的序列融合,构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体并经测序验证。该融合蛋白在BL21(ED3)中获得高效表达,约占菌体总蛋白的30％;产物相对分子质量约为34 kD,与理论大小一致。Western印迹分析显示融合蛋白完全存在于包涵体中。结论：成功克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA,构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达,为制备HLA-A*0203四聚体打下基础。