鸡白痢沙门菌S06004株致病岛-2缺失株的构建及其生物学特性

摘要:【目的】了解致病岛-2(Salmonella Pathogenicity Island 2,SPI-2)对鸡白痢沙门菌致病性的影响,初步探讨研制安全有效的鸡白痢沙门菌减毒株的可行性。【方法】采用λ-red 同源重组系统构建鸡白痢沙门菌S06004株的SPI-2(约40 kb)缺失株S06004ΔSPI2。并与野生型相比较,对该缺失株的生长特性、生化特性、遗传稳定性和致病性等基本生物学特性进行鉴定。【结果】成功构建SPI-2缺失株S06004ΔSPI2,SPI-2的缺失不影响鸡白痢沙门菌的生长特性和生化特性,且该缺失株具有良好的遗传稳定性,其对2日龄雏鸡的LD50是野生株的252 倍。【结论】SPI-2的缺失引起鸡白痢沙门菌毒力的明显下降,这为进一步研究鸡白痢沙门菌SPI-2的功能及制备减毒疫苗奠定了基础。     

鸡白痢沙门菌ipaJ基因的克隆与鉴定

摘要：【目的】从鸡白痢沙门菌C79-13中克隆ipaJ基因,体外表达该蛋白后进行免疫原性分析。【方法】鸡白痢沙门菌C79-13与肠炎沙门菌50041进行抑制差减杂交后获得的片段PEA2、PE31和PE44与猪霍乱沙门菌C500疫苗株pSFD10质粒上ipaJ基因高度同源,拼接后获得了鸡白痢沙门菌完整的ipaJ基因序列。从鸡白痢沙门菌中克隆出ipaJ基因并将其构建到原核表达载体pET-30a(+)上,Western-blot检测体外表达蛋白的免疫原性,同时检测了该基因在鸡白痢沙门菌分离株中的分布。【结果】从鸡白痢沙门菌中克隆了大小为840 bp的ipaJ基因序列,并获得了体外原核表达的大小为37 kDa融合蛋白。该蛋白可与鸡白痢沙门菌阳性血清反应。PCR结果显示该基因广泛存在于鸡白痢沙门菌菌株中。 【结论】本文首次报道和克隆了鸡白痢沙门菌ipaJ基因,并证明了IpaJ蛋白具有免疫原性。     

鼠伤寒沙门菌rtsB基因缺失株的构建及其生物学特性

【背景】鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)是一种重要的人畜共患病原菌,严重危害养殖业及人类健康。调控蛋白在病原菌的生存及感染过程中发挥重要作用。【目的】构建鼠伤寒沙门菌调控基因rtsB缺失株和互补株,分析调控蛋白RstB对鼠伤寒沙门菌生物学特性和致病性的影响。【方法】利用Red同源重组的方法构建鼠伤寒沙门菌SAT52的rtsB基因缺失株,并利用互补质粒构建互补株。然后比较分析野生株SAT52、缺失株?rtsB和互补株C?rtsB的生长特性、运动性、生物被膜形成能力、黏附入侵能力、胞内存活能力及致病性的差异。【结果】缺失rtsB基因不影响SAT52的生长速度,但导致运动能力增强,生物被膜形成能力减弱。细胞感染试验结果表明,rtsB基因有助于鼠伤寒沙门菌对Hela细胞的黏附入侵及RAW264.7细胞内的存活。动物试验结果表明rtsB基因缺失显著降低鼠伤寒沙门菌的致病力。【结论】rtsB基因在鼠伤寒沙门菌感染过程中发挥重要作用,可为阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制提供参考。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统的构建及其雏鸡免疫保护试验

摘要:【目的】为构建鼠伤寒沙门菌环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统,并对其生物学特性进行检测。【方法】以鼠伤寒沙门菌SL1344Δcya株为亲本株,利用重组自杀性质粒(pREΔasd)介导的同源重组技术,经两步法缺失并筛选asd基因缺失株(SL1344Δcya Δasd)。将含asd基因且无抗性的pYA3493质粒电转化至缺失株SL1344ΔcyaΔasd,构建重组菌株SL1344ΔcyaΔasd (pYA3493)。【结果】试验结果表明,重组菌株SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)生化特性和生长速度与参考株SL1344相比差异较大,与亲本株SL1344Δcya基本一致,SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2 S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力。对1日龄雏鸡攻毒试验表明,SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)毒力较参考株SL1344降低了约104倍。免疫保护试验显示,1日龄雏鸡免疫SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)后第17天,利用鼠伤寒沙门菌参考株攻毒,保护率为62.5%。【结论】鼠伤寒沙门菌SL1344株环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统构建成功,且具有较好的免疫保护性,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服疫苗奠定基础。     

抗鸡白痢益生菌株的筛选

利用从健康蛋鸡和肉鸡肠道内分离的菌株以及本实验室保存菌,在体外分别与鸡白痢沙门菌强毒株作用48h后,以涂片染色镜检法和菌落计数法筛选出对鸡白痢沙门菌有抑制作用的5株细菌,即鸡粪肠球菌、鸡非致病性大肠埃希菌、环状芽胞杆菌、酵母菌和乳酸菌,抑制率分别为97.8%、99％、99.9％、98.2％和78％。     

鼠伤寒沙门菌baeSR基因缺失株的构建及其对抗生素敏感性分析

【背景】沙门菌的多重耐药现象日渐严重,对其耐药机理的研究尤为迫切,双组分系统与细菌耐药性密切相关。【目的】构建鼠伤寒沙门菌baeSR基因缺失株及回补株,探究双组分系统BaeSR对鼠伤寒沙门菌耐药性的影响。【方法】以鼠伤寒沙门菌体外诱导耐药株CR为研究对象,通过自杀质粒p LP12介导的同源重组方法,以氯霉素抗性标记和阿拉伯糖诱导的致死基因vmt进行正、反向双重筛选,获得基因缺失株CRΔbaeSR,并将重组表达质粒pBAD-baeSR转化于CRΔbaeSR构建回补株CR CΔbaeSR。采用微量肉汤稀释法测定11种常见代表药物对野生株、缺失株及回补株的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC),并测定3株菌的生长曲线、运动性及生物膜形成能力。【结果】与野生株相比,环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)、沙拉沙星(SAR)、头孢噻呋(CEF)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、安普霉素(APR)对缺失株的MIC值有所下降;缺失株的生长速率稍显缓慢,且最终浓度也相对较低,但并无统计学上的显著差异(P0.05);缺失株的运动性(P0.05)及生物膜形成能力(P0.01)均显著下降。【结论】鼠伤寒沙门菌baeSR基因缺失后,可通过影响其运动性及生物膜形成能力而对抗生素的敏感性产生影响。     

复合型菌剂对鸡白痢菌的抑制作用及其各菌在鸡体内定居情况

利用由鸡粪肠球菌、鸡非致病性大肠埃希菌、芽胞杆菌、酵母菌和乳酸菌组成的复合菌剂在体外与鸡白痢沙菌门作用,结果表明,鸡白痢沙门菌生长明显受到抑制,抑制率达90％以上。并且还测定其各菌的有关生物特性以及雏鸡体内的定居情况：胆盐耐受范围在1.2%-1.4%之间;苯酚耐受范围在0.1%－0.2%之间;耐酸范围在pH3.0-2.5之间;在雏鸡体内除芽胞杆菌为过路菌外,其他菌均可定居于盲肠、中肠、肌胃、素囊中。     

鼠伤寒沙门菌spvBC基因编辑株的构建

利用λRed重组系统和pBAD原核表达载体构建鼠伤寒沙门菌spvBC质粒毒力基因修饰菌株,为深入探究沙门菌毒力基因spv的功能和致病机制及宿主抗感染免疫提供工具菌。以pKD4为模板,PCR扩增含spvBC同源臂的卡那霉素抗性基因以构建同源打靶片段,再将其电转入含有质粒pKD46的鼠伤寒沙门菌中进行同源重组,随后将质粒pCP20电转导入阳性转化子,消除卡那霉素抗性基因,PCR鉴定敲除株的构建。PCR扩增含酶切位点的spvBC基因片段,扩增产物与原核表达载体pBAD/gⅢ分别双酶切后连接构建pBAD-spvBC重组质粒,PCR筛选阳性菌落并测序鉴定。将构建成功的pBAD-spvBC重组质粒电转导入spvBC敲除株中,Western blot测定不同浓度L-阿拉伯糖诱导SpvB和SpvC蛋白表达情况。PCR结果表明鼠伤寒沙门菌spvBC基因敲除成功;PCR及测序结果表明pBAD-spvBC重组质粒构建成功,Western blot结果表明13 mmol/L L-阿拉伯糖可诱导SpvB和SpvC蛋白正常表达。λRed重组系统可用于沙门菌质粒上大片段基因的敲除,pBAD原核表达载体可用于沙门菌质粒上大片段基因的回补,丰富了细菌质粒的基因修饰和编辑策略。     

HV-MDV变异株meq基因编辑缺失疫苗候选毒株的构建及免疫保护评价

马立克病（Marek’s disease,MD）是由马立克病病毒（Marek’s disease virus,MDV）感染引起的一种危害严重的家禽免疫抑制病与肿瘤病,给全球养殖业造成巨大经济损失。尽管MD疫苗免疫对该病具有显著防控效果,但长期的免疫压力不断促进MDV毒力增强及变异。近年来,新出现的MDV特超强毒株（Very virulent plus MDV,vv+MDV）和特超强MDV(Hypervirulent MDV,HV-MDV)变异株已突破经典MD疫苗的免疫保护,亟需研发新一代高效疫苗。本文以2021年分离鉴定的HV-MDV变异株HNXZ05为研究对象,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,成功构建了一株meq基因编辑缺失的疫苗候选毒株XZ05Δmeq。经PCR鉴定、DNA测序分析、间接免疫荧光实验（IFA）、实时荧光定量PCR(qPCR)以及连续传代分析,证实该毒株的meq基因已被完全编辑缺失、稳定传代后无回复突变。动物免疫保护评价实验显示,用候选疫苗株XZ05Δmeq免疫SPF鸡,对HV-MDV变异株HNSQ01的攻击可提供82.4%的免疫保护;与阴性对照组相比,免疫攻毒组实验鸡的体重及免疫器官指数均未受到显著影响。上述数据表明,XZ05Δmeq可作为MD疫苗候选毒株,用于进一步开发新型高效的MD疫苗,以应对当前鸡群HV-MDV变异株流行带来的防控新挑战。     

伤寒沙门菌bcfD基因敲除突变株的构建

目的:构建伤寒沙门菌Ty2菌株菌毛亚单位bcfD基因敲除突变株.方法:利用交错PCR得到bcfD基因缺失且含其两侧翼序列的片段,将该片段与pMD 18-T连接,亚克隆到pYG4,电转入大肠埃希菌S17-1/λpir菌株,阳性菌株与受体菌伤寒沙门氏菌Ty2进行固相杂交后筛选.结果:成功获得敲除bcfD基因序列954bp的敲除突变株.结论:交错PCR有利于细菌基因精确敲除突变株的构建,bcfD基因敲除株的构建将为进一步研究该基因在伤寒沙门菌中的功能奠定了基础.     

Low expression of AcrB in the deoxycholate-sensitive strains of Salmonella enterica subspecies enterica serovar Pullorum

We investigated the mechanism responsible for bile susceptibility in three deoxycholate-sensitive (DCs) strains of Salmonella enterica subspecies enterica serovar Pullorum isolated in 1958 in Japan. Of the genes encoding the AcrAB-TolC efflux system, the expression of acrB mRNA was 10-fold lower in the DCs strains than in a deoxycholate-resistant (DCr) strain, whereas those of the acrA and tolC genes were two-fold lower. These results suggested that low expression of acrB was strongly correlated with bile susceptibility in the DCs strains. In addition, the increase in tolC expression levels was not detected in the DCr mutants derived from the DCs strains, suggesting that difference in the expression levels of tolC is not associated with bile susceptibility.     

Reducing colonization of Salmonella Enteritidis in chicken by targeting outer membrane proteins

AIMS: To evaluate the ability of Salmonella enterica ser. Enteritidis outer membrane proteins (OMPs) of 75.6 and 82.3 kDa to inhibit or reduce in vivo colonization of S. Enteritidis on intestinal mucosa in chickens. METHODS AND RESULTS: Nine-week-old specific-pathogen-free chickens were subcutaneously immunized with 75.6 or 82.3 kDa protein, and challenged with a virulent strain of S. Enteritidis. Chickens were killed, and portions of small intestine and caecum were removed at necropsy. The population of S. Enteritidis attached to chicken intestinal mucosa was determined. The population of S. Enteritidis recovered from the small intestine and caecum of chickens immunized with 75.6 or 82.3 kDa protein was significantly (P < 0.05) lower than that recovered from the control birds. CONCLUSIONS: Salmonella Enteritidis OMPs 75.6 kDa and 82.3 kDa were effective in reducing colonization of S. Enteritidis on intestinal mucosa in chickens. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: Salmonella Enteritidis OMPs 75.6 or 82.3 kDa could be used as potential vaccines to reduce S. Enteritidis colonization in chickens.     

以减毒沙门氏菌为载体的小鼠肝炎病毒DNA疫苗的构建及其免疫原性

目的：构建以减毒沙门氏菌为载体的小鼠肝炎病毒DNA疫苗,研究该疫苗的免疫原性。方法：以小鼠肝炎病毒S1基因的重组真核表达质粒pVAX1—S1免疫BALB／c小鼠,ELISA检测其诱导抗体产生情况;再将重组质粒pVAX1—S1电转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,构建运送S1基因的重组减毒沙门氏菌SL7207（pVAX1—S1）,口服免疫BALB／c小鼠,间接免疫荧光试验鉴定减毒沙门氏菌运送的DNA疫苗的免疫原性。结果：与pVAX1空载体对照组相比,重组真核表达质粒pVAX1—S1免疫组二免及三免后抗体水平分别存在显著性差异（P〈0．05）和极显著性差异（P〈0．01）。减毒沙门氏菌运送的DNA疫苗SL7207（pVAX1—S1）诱导小鼠产生了特异性的血清抗体。结论：构建的重组减毒沙门氏菌SL7207（pVAX1—S1）具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生特异性的体液免疫应答。这为进一步研制冠状病毒新型基因疫苗奠定了基础。     

痢疾杆菌酸抗性系统相关基因缺失突变体的构建

依赖于谷氨酸脱羧酶的酸抗性系统对痢疾杆菌在宿主细胞内的生存和繁殖至关重要,hdeA、hdeB、yhiE和yhiF是其中几个重要的酸抗性基因。借助Red系统的重组功能,PCR扩增两翼与目的基因上下游同源的抗性基因片段,电击转化痢疾杆菌2457T,对筛选到的阳性转化子再导入编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20以去除抗性基因。结果成功的敲除了hdeA、hdeB、yhiE和yhiF等4个酸抗性系统相关基因,为深入研究痢疾杆菌酸抗性基因的调控网络奠定了基础.     

炭疽芽胞杆菌假想S-层蛋白SLP缺失突变体的构建

目的：构建炭疽芽胞杆菌假想S-层蛋白SLP缺失突变体,以进行后续SLP的功能研究,为炭疽芽孢杆菌重要基因功能的研究建立技术平台。方法：利用PCR技术,分别扩增得到目的基因的上游同源臂（slp-F）和下游同源臂（slp-R）,将抗性基因（S）和上、下游同源臂先后连入穿梭质粒pKSV7,构建打靶载体pKSV7-FSR,经去甲基化后,电转化入炭疽芽胞杆菌A16R,通过同源重组敲除slp基因,并通过DNA测序和Western blot实验验证;对野生株和突变株37℃时的生长曲线及生化反应进行比较研究。结果：分别从DNA水平和蛋白质水平证实slp基因被成功敲除;突变株对数期生长较快,衰退较慢,与野生株的生化反应差异不明显。结论：获得了炭疽芽胞杆菌假想S-层蛋白SLP缺失突变体。     

布鲁氏菌2308ery基因启动子缺失株的构建及鉴定

目的:构建布鲁氏菌2308株ery基因启动子缺失株。方法:用PCR方法从亲本株2308上扩增ery基因启动子侧翼序列,将该片段与pMD19-T连接,亚克隆为自杀载体pGEM-7zf-Δery-sacB。将自杀载体电转化布鲁氏菌感受态细胞中经同源重组后,分别用100 mg/L氨苄和7%蔗糖筛选。对获得的基因缺失株进行RT-PCR鉴定和遗传稳定性检测。结果:成功获得ery基因启动子缺失株,2308Δery基因启动子缺失株未扩增出eryA基因。并且该缺失株在10代以内未发生回复突变。结论:成功构建2308Δery基因启动子缺失株,为研究布鲁氏菌的毒力基因及其流产机制奠定基础。     

炭疽芽胞杆菌mntA基因缺失突变株的构建及鉴定

目的:通过同源重组的方法敲除炭疽芽胞杆菌减毒AP422株的mntA基因,使菌株进一步减毒,用于构建新的疫苗候选株。方法:利用PCR方法扩增mntA基因上下游同源臂后与温敏质粒连接,构建打靶载体,并转化炭疽芽胞杆菌减毒AP422株;利用抗生素和温度2种选择压力实现同源重组,敲除目标基因mntA,然后利用Cre-LoxP系统去除抗性筛选标记,得到无抗性标记的缺失突变株,并利用PCR和Western印迹等方法对重组菌进行系统鉴定,最后分析突变株的生物学性状。结果:敲除了AP422株的mntA基因,获得了无抗性标记的缺失突变株,突变株的生存竞争能力比原始菌株明显减弱。结论:突变株获得了进一步减毒,可用于构建新的疫苗候选株。     

肿瘤生物治疗的新方法——减毒鼠伤寒沙门菌的应用

减毒鼠伤寒沙门菌由于具有肿瘤靶向性,能在肿瘤组织中复制并产生抗肿瘤效果的能力,使肿瘤治疗获得了新契机。减毒鼠伤寒沙门菌作为细菌载体使目的基因在肿瘤组织内特异表达,表现出良好治疗效果。近期研究发现,单独使用突变后的菌株A1-R在裸鼠模型上治疗乳腺癌和前列腺癌分别可达到40％和50％的治愈率;在小鼠肿瘤转移模型中也展现出良好的治疗效果。鼠伤寒沙门菌作为肿瘤治疗制剂有诱人的前景。本文就这些研究的最新进展做一综述。     

Salmonella vaccines for use in humans: present and future perspectives

In recent years there has been significant progress in the development of attenuated Salmonella enterica serovar Typhi strains as candidate typhoid fever vaccines. In clinical trials these vaccines have been shown to be well tolerated and immunogenic. For example, the attenuated S. enterica var. Typhi strains CVD 908-htrA (aroC aroD htrA), Ty800 (phoP phoQ) and chi4073 (cya crp cdt) are all promising candidate typhoid vaccines. In addition, clinical trials have demonstrated that S. enterica var. Typhi vaccines expressing heterologous antigens, such as the tetanus toxin fragment C, can induce immunity to the expressed antigens in human volunteers. In many cases, the problems associated with expression of antigens in Salmonella have been successfully addressed and the future of Salmonella vaccine development is very promising.