青花菜雄性不育相关基因BoDHAR的克隆与表达分析

以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段的序列为信息探针,通过在NCBI与TAIR网站数据库中进行同源EST序列搜索,经人工拼接、RT-PCR、PCR克隆与序列分析,获得了青花菜脱氢抗坏血酸还原酶DHARdehydroascorbatereductase基因的cDNA与DNA全长序列,命名为BoDHAR。并利用双链接头介导PCR的染色体步行技术(genomewalking)克隆了其上游644bp的5′端序列。所获的BoDHAR基因全长1486bp,存在两个内含子,DNA编码区序列633bp,编码210个氨基酸;序列分析表明BoDHAR与同源基因AT1G19570.1cDNA序列有82.3%的一致性,推导的氨基酸序列有79.6%的一致性;编码的水溶性蛋白存在多个磷酸化位点;5′端上游区存在明显的转录调控序列。半定量RT-PCR结果表明BoDHAR在可育系花蕾中的表达量明显高于不育系花蕾,在花药中的表达明显高于其它部位。     

白菜小孢子发育相关基因BcMF3的分离及序列分析

利用cDNA-AFLP技术对‘矮脚黄’白菜(Brassica campestris L．ssp．chinensis Makinovar．communis Tsen et Lee cv,Aijiaohuang)雄性不育两系不育株系与可育株系的表达差异进行分析,结果以A18和T16引物为引物对在可育的中蕾和大蕾中筛选出一条474bp特异表达的差异条带BA18-T16,配合RACE方法扩增了该片段的3’和5’末端,获得了该基因的cDNA全长序列BcMF3。BcMF3全长2082bp,开放阅读框长度为1755bp,编码584个氨基酸。序列分析结果表明,BcMF3基因与油菜、大白菜和拟南芥的花药特异表达果胶甲酯酶(PME)基因具有较高的相似性,由此推定,BcMF3基因为白菜花药特异表达的果胶甲酯酶基因。     

一个白菜花粉发育相关的新基因BcMF7的鉴定

利用cDNA-AFLP技术分析了白菜(Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino, syn. B. rapa L. ssp. chinensis)雄配子减数分裂的胞质分裂突变体(male meiotic cytokinesis, mmc)和野生型植株花蕾基因表达的差异, 克隆了其中一个在野生型花蕾中特异表达的基因BcMF7, 序列分析发现该基因的最大开放阅读框为390 bp, 编码129个氨基酸, 推测的蛋白质分子量为13.75 kD, 含有8个蛋白激酶C磷酸化位点, 2个酪蛋白激酶II磷酸化位点, 2个酪氨酸激酶磷酸化位点, 2个N-糖基化位点以及2个N-豆蔻酰化位点等, 这些位点均与细胞内信号传导、蛋白定位以及黏附等过程有关. 时空表达特点分析发现BcMF7在花粉中特异表达, 其转录本最早在花粉发育的四分体时期开始出现, 在单核小孢子时期表达丰度达到最高, 随后在成熟花粉粒形成时期表达量又有所下降. 推测BcMF7可能在花粉发育的四分体时期到成熟花粉粒形成过程的信号传导中发挥重要作用.     

不结球白菜PR4蛋白基因的克隆与诱导表达分析

从不结球白菜抗病品种‘苏州青’中克隆到一个受SA和病原菌诱导的病程相关蛋白4(PR4)基因,命名为BcPR4(DDBJ登录号:AB325873),该基因核苷酸序列全长593 bp,编码140个氨基酸,与其它植物的PR4蛋白基因具有较高的相似性。系统进化树分析表明,该基因在不同物种之间具有保守性。基因组DNA杂交表明BcPR4属于多基因家族。实时定量PCR(qPCR)检测表明,SA和Peronospora parasitica均能诱导不结球白菜BcPR4转录表达,BcPR4在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病原菌的抗性。     

不结球白菜乙烯响应因子基因的克隆与表达分析

采用cDNA-AFLP技术,以不结球白菜雄蕊突变系‘苏白2号’及其保持系花蕾为实验材料,分离出1条编码乙烯响应转录因子的基因,命名为NhccERF1。结果显示:(1)序列分析表明,NhccERF1基因长807bp,编码268个氨基酸。(2)RT-PCR分析发现,花期NhccERF1基因在花瓣、雄蕊及花柱中表达量均显著高于保持系。(3)实时定量荧光PCR(qPCR)发现,蕾期喷施乙烯(ET)能促进NhccERF1基因的表达,外施AgNO3抑制该基因表达。研究推测NhccERF1基因可能在雄蕊变异中发挥重要作用。     

白菜雄性不育相关基因BcMF4基因功能的RNAi验证

BcMF4(Brassica campestris Male Fertility 4)是前一阶段从普通白菜 (Brassica campestris ssp. chinensis var. communis, syn. B. rapa ssp. chinensis var. communis)核雄性不育两用系的可育株中分离到的雄性不育相关基因。本研究根据BcMF4基因的cDNA序列设计两对特异引物, 从普通白菜花蕾cDNA中扩增出两个片断后连接至双元载体pBI12l中, 得到了RNAi (RNA interference) 植物表达栽体pBI-B4R, 并导入了农杆菌LBA4404菌株中; 通过组织培养途径转化菜心(B. campestris ssp. chinensis var. parachinensis), 72.2%的菜心转基因植株中45.8%的花粉为缩小而空瘪的畸形, 而且这些植株的花粉离体萌发率降低至23.7%; Northern杂交显示, 转基因植株的花粉畸形, 是由于BcMF4基因片段的插入使BcMF4基因的表达受到了抑制。结果表明, 采用RNAi技术下调了BcMF4基因的表达, 导致了菜心转基因植株部分花粉的不育, 证明BcMF4基因在普通白菜和菜心等白菜植物的花粉发育中起着重要作用。     

花粉发育相关基因BcMF13不同转录本的克隆及分析

在克隆花粉发育相关基因BcMF13时,用RACE技术进行3’端扩增,得到了两个不同长度的3’转录本。与EST库比对,发现与其相似性高的序列都来源于十字花科芸薹属、萝卜属等植物的生殖器官,并且在这些近源属中也出现不同转录本。这些不同转录本的存在说明BcMF13存在剪切异构体,调控过程灵活复杂,反映出该基因具有重要功能。同时,对BcMF13基因的RT-PCR表达研究表明,它只在可育株系中表达,在不育株系中不表达,且主要集中在大花蕾、雄蕊中表达。分析BcMF13推导的蛋白结构,发现其编码的蛋白包含多个生物活性位点。以上结果均表明BcMF13与花粉育性相关,多个剪切异构体的发现说明BcMF13在执行生理功能时较为活跃。     

不结球白菜细胞质雄性不育相关基因的克隆及表达

从不结球白菜CMS新种质中分离得到的一个cDNA-AFLP差异片段,采用RT-PCR和RACE技术成功克隆了一个α-微管基因的cDNA全长序列,命名为TUBA2(DDBJ登录号为AB445012)。序列分析结果表明,该基因全长1 709 bp,最大开放阅读框为1 353 bp,编码450个氨基酸序列,与已公布的α-微管基因有较高的同源性。系统进化树分析发现,该基因在不同植物间具有高度保守性。Southern杂交表明TUBA2属于不结球白菜多基因家族的一个单一克隆基因。实时定量RT-PCR检测表明,该基因在不育系中的表达量显著低于保持系,同时在不同组织和细胞减数分裂不同时期该基因的表达量也存在明显差异。     

北京地区油菜软腐病病原菌的鉴定

摘要:【目的】确定引发北京地区油菜［Brassica campestris L．ssp．chinensis (L.) Makino var． communis Tsen et Lee］软腐病的病原。【方法】结合病原菌形态、BIOLOG 及生理生化、16S rＲNA 基因序列及亚种IGS区特征分析,对从北京大兴和通州区油菜软腐病样中病原菌进行生物学鉴定。【结果】分离的40 个菌株均能引发 油菜软腐病,但分别为胡萝卜果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum) 的2个不同亚种,其中13株为P．carotovorum subsp．carotovorum(Pcc),另27株为P．arotovorum subsp． brasiliensis(Pcb)。接种白菜(Brassica campestris L．ssp．pekinensis)致病力测定分析表明,亚种内、来源相同与16S rRNA基因序列相同的菌株间均存在明显的致病力分化。【结论】Pectobacterium carotovorum subsp．carotovorum和Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis是引发北京地区油菜软腐病的致病菌,后者为首次报道能引起白菜类蔬菜软腐病的常见致病菌。     

不结球白菜热激蛋白基因克隆及表达

从不结球白菜'暑绿'中克隆到一个受热激诱导的小分子量热激蛋白(sHSP)基因,命名为BcHSP(DDBJ登录号为AB367955),该基因核苷酸序列全长722 bp,编码157个氨基酸,与芜菁、芥蓝、拟南芥等有90%以上的相似性.实时定量检测表明,不结球白菜BcHSP转录表达受热激诱导,以叶片中表达量最高,BcHSP在不结球白菜叶片中表达特征说明它可能与植物叶片的耐热性关系更为密切.     

不结球白菜BcTuR1基因的克隆及表达

从不结球白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)品种‘短白梗'中克隆到一个抗TuMV相关基因,命名为BcTuR1(GenBank登录号FJ600374).该基因核苷酸序列全长1 019 bp,编码162个氨基酸.BcTuR1基因与芥菜抗病毒基因相似性最高为96%,其它没有与该基因相似性高于50%的序列.基因组DNA杂交表明,BcTuR1可能属于一个较小的多基因家族.实时定量PCR检测表明,芜菁花叶病毒能够诱导不结球白菜BcTuR1基因的转录表达,其在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病毒的抗性.     

小白菜种质资源对小菜蛾的抗性评价

本文就小白菜种质资源对小菜蛾的抗性进行室内鉴定,结果表明268份材料的虫害指数分布在18.10～100.00之间,种质资源间抗虫性差异达到显著水平.聚类分析将268份种质资源分为6大类,与高抗、抗、中抗、中感、感、高感相对应,其中筛选出高抗和抗性材料分别为6和11份.对268份材料的主要形态性状与虫害指数和抗性级别的相关分析表明,小白菜种质资源叶面的皱缩度与抗虫性存在一定的相关性,认为从叶面平滑型的种质资源中筛选抗虫性材料的可能性更大.     

30个不结球白菜品种的耐弱光性鉴定

用人工遮荫技术对不同来源的30个不结球白菜品种进行弱光处理,以干物质减少百分率、叶片厚度减少百分率和叶绿素a/b减少百分率3个指标作为评价标准,用系统聚类分析方法,将30个供试不结球白菜品种按其耐弱光性分为3类,即耐弱光性强、耐弱光性中等和不耐弱光品种。其中耐弱光性强的品种6个,占全部样品的20%;耐弱光性中等的品种15个,占50%;不耐弱光的品种9个,占30%。方差分析结果表明,3类品种间的耐弱光性指标差异极显著。其中,品种暑绿、正大抗热青3号、热优2号、抗热605、矮王、华王属于耐弱光品种。     

秸秆浸提液漂浮栽培对不结球白菜产量及相关品质特性的影响

以1/4园试营养液为对照,以腐熟发酵的农业秸秆(苋菜和番茄植株残体)浸提液模拟富含N、P的水体进行不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)的漂浮栽培,对茎叶的单株鲜质量和干质量及叶片的VC、可溶性蛋白质、蔗糖、果糖、葡萄糖含量及可溶性糖总含量进行了比较分析。结果表明:在24 d的栽培周期内,随生长时间的延长,处理组和对照组茎叶的单株鲜质量和干质量均呈增加趋势,但从第10天开始,处理组茎叶的单株鲜质量和干质量均显著低于对照组。栽培初期叶片VC含量均最高且处理组叶片VC含量显著低于对照组;从第10天开始,叶片VC含量降低,但处理组叶片VC含量与对照组无显著差异。处理组与对照组叶片可溶性蛋白质含量均呈波动的变化趋势,但总体差异不显著。处理组叶片蔗糖含量总体上与对照组差异不显著,仅在第24天显著低于对照组。处理组叶片的果糖含量均高于对照组,特别是在第24天为对照组的1.81倍,差异显著。叶片葡萄糖含量均呈先升高后降低的趋势,可溶性糖总含量则呈波动的变化趋势,对照组叶片葡萄糖含量和可溶性糖总含量总体上高于处理组,但差异不显著。研究结果显示:用秸秆浸提液漂浮栽培,虽然不结球白菜的生长量(即产量)有所减少,但相关的品质指标变化不大,对果糖合成和积累还有一定的促进作用,因而,此种秸秆浸提液可用于栽培商品不结球白菜。     

正交设计优化不结球白菜ISSR反应体系研究

利用正交试验设计,从Mg2+、dNTP、引物、甘油4种因素3个水平,对不结球白菜ISSR反应体系进行优化,确立了适合不结球白菜的ISSR反应体系:在20μL反应体系中,含1×PCRbuffer,1.5mmol·L-1MgCl2,200μmol·L-1dNTP,0.5μmol·L-1引物,1%甘油,30ng模板DNA,1UTaqDNA聚合酶.通过梯度PCR测验,确定了适宜的退火温度.     

钙、水杨酸和壳聚糖复配处理对小白菜抗盐性的诱导

以小白菜(Brassica campestris ssp.chinensis L.)为对象,采用根际施用结合叶面喷洒的方法,研究CaCl2、壳聚糖(chitosan,CTS)和水杨酸(salicylic acid,SA)两两复配及三元复配对小白菜盐胁迫逆境的诱抗作用。结果表明:SA,CTS,CaCl2复配施用均能显著降低盐胁迫下小白菜的盐害指数,降低小白菜叶片的丙二醛(MDA)含量,增强过氧化物酶(POD)活性,提高叶绿素含量。各处理以CTS+CaCl2复配施用对小白菜的诱导抗盐效果最好,对小白菜生长的促进作用最显著。SA,CTS,CaCl2三元复配的效果不如二元复配效果好,复配后存在一定的拮抗作用。