减毒沙门氏菌作为抗肿瘤及肿瘤基因治疗载体的研究进展

减毒沙门氏菌在作为疫苗用于预防疾病的同时,其抗肿瘤特性及作为肿瘤基因治疗载体的研究已成为研究热点。对沙门氏菌的抗肿瘤作用、减毒沙门氏菌的抗肿瘤研究及减毒沙门氏菌作为肿瘤基因治疗载体的相关研究进展等进行了较系统的综述。     

肿瘤生物治疗的新方法——减毒鼠伤寒沙门菌的应用

减毒鼠伤寒沙门菌由于具有肿瘤靶向性,能在肿瘤组织中复制并产生抗肿瘤效果的能力,使肿瘤治疗获得了新契机。减毒鼠伤寒沙门菌作为细菌载体使目的基因在肿瘤组织内特异表达,表现出良好治疗效果。近期研究发现,单独使用突变后的菌株A1-R在裸鼠模型上治疗乳腺癌和前列腺癌分别可达到40％和50％的治愈率;在小鼠肿瘤转移模型中也展现出良好的治疗效果。鼠伤寒沙门菌作为肿瘤治疗制剂有诱人的前景。本文就这些研究的最新进展做一综述。     

沙门氏菌抗肿瘤疗法在合成生物学时代的发展和机遇

在世界各国，癌症是导致死亡的主要原因之一，也是提高人类预期寿命的重要障碍。目前临床上主流的分子靶向疗法和免疫疗法还不能完全治愈肿瘤且常常副作用巨大，其中原因较为复杂。而以沙门氏菌抗肿瘤疗法为代表的细菌抗肿瘤疗法具有潜力弥补分子靶向疗法和免疫疗法在肿瘤靶向性上的不足。本文将从目前癌症治疗的困境出发，回顾细菌抗肿瘤疗法的历史，阐述基因工程与合成生物学时代沙门氏菌抗肿瘤疗法的进展，论述其作为下一代抗肿瘤微型机器人的潜力。最终，我们希望在靶向肿瘤治疗领域激发思想火花，克服沙门氏菌抗肿瘤疗法的局限性，推进其临床应用。     

应用遗传改造的沙门菌介导肿瘤治疗的研究进展

肿瘤是机体在各种致瘤因子作用下,局部组织细胞异常增生所形成的赘生物。肿瘤治疗一直是临床上的一个难题,而放疗、化疗和手术等常规的肿瘤治疗方法均具有明显的局限性。早期研究发现某些厌氧菌或兼性厌氧菌具有抗肿瘤效应,例如兼性厌氧菌鼠伤寒沙门氏菌可以通过某些机制选择性定殖于肿瘤并抑制肿瘤生长,其应用于肿瘤治疗具有许多潜在的优势。过去的一二十年里,已有不少研究者通过遗传操作减弱沙门菌毒力,提高其定殖肿瘤的靶向性,或以减毒沙门菌作为载体向肿瘤靶向递呈各种治疗分子,并在许多动物试验中观察到遗传改造沙门菌的良好抗肿瘤效应。随着沙门菌抗肿瘤研究的不断深入,应用遗传改造的沙门菌有希望成为一条更有效的肿瘤治疗途径。本文将从沙门菌的抗肿瘤机制、遗传改造的沙门菌介导肿瘤治疗的研究进展和目前研究存在的问题等方面进行综述。     

减毒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的研究进展

随着沙门氏菌基因组学的深入研究以及DNA重组技术的发展,使得对沙门氏菌进行精确的不可回复性的基因缺失减毒成为可能。减毒沙门氏菌可作为DNA疫苗载体,特异性地将其携带的质粒DNA靶向性的传递给巨噬细胞、树突细胞等抗原递呈细胞,从而有效激发相应的体液与细胞免疫应答。减毒沙门氏菌已作为疫苗载体在针对细菌、病毒、寄生虫等的DNA疫苗研究中得以广泛应用。     

运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌载体系统

减毒沙门氏菌通过自然感染的方式高效地将DNA疫苗直接运送给体内的抗原提呈细胞(APCs)如树突细胞(DCs)和巨噬细胞,在粘膜和全身淋巴组织诱发以Th1型应答为主的细胞免疫和体液免疫,APCs尤其是DCs可能在其中起到了关键作用.减毒沙门氏菌已被应用于运送病毒、细菌和肿瘤DNA疫苗并取得一定效果,该途径所诱发的细胞免疫要强于肌注途径接种的相同DNA疫苗,原核表达的重组沙门氏菌和接种蛋白质抗原等免疫方法.本文还对如何增强携带DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌的免疫效果作了探讨.     

运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌载体研究

减毒沙门氏菌通过自然感染的方式高效地将DNA疫苗直接运送给体内的抗原提呈细胞（APCs)如树突细胞（DCs)和巨噬细胞,在粘膜和全身淋巴组织诱发以Th1型应答为主的细胞免疫和体液免疫,APCs尤其是DCs可能在其中起到了关键作用。减毒沙门氏菌已被应用于运送病毒,细菌和肿瘤DNA疫苗并取得一定效果,该途径所诱发的细胞免疫要强于肌注途径接种的相同DNA疫苗,原核表达的重组沙门氏菌和接种蛋白质抗原等免疫方法。本文还对如何增强携带DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌的免疫效果作了探讨。     

表达VP3重组减毒沙门氏菌的构建和融合蛋白纯化

寻求有效的肿瘤基因疗法,构建鸡贫血病毒VP3的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗,并获得较纯的表达VP3基因的融合蛋白,初步研究其免疫原性.采用PCR技术扩增VP3基因,并将其与原核载体pET32α( )重组.将重组后质粒转染E.coli BL21,得到表达VP3的融合蛋白,并将此蛋白通过50%的Ni -NTA亲和树脂纯化.同时将重组质粒转染减毒沙门氏菌SL7207.经双酶切和PCR鉴定,成功构建了表达VP3的减毒沙门氏菌苗.融合蛋白通过50%的Ni -NTA亲和树脂纯化,得到纯度在90%以上的纯化蛋白.成功构建了表达VP3的减毒沙门氏菌苗,并且获得纯化的表达VP3的融合蛋白,为进一步研究VP3的免疫保护作用及对抗肿瘤疫苗的研制打下基础.     

细菌与免疫疗法联用的抗肿瘤策略

利用细菌作为一种癌症治疗手段已有较长的历史。随着对肿瘤微环境和免疫机制等相关问题的不断探究,细菌疗法已逐渐发展成为一种平台技术,为肿瘤的免疫治疗开辟了新策略、新潜能。某些细菌依靠其自身特性,能够特异性靶向肿瘤组织,不仅对肿瘤生长产生直接抑制作用,还能刺激机体产生固有和适应性免疫应答,从而显著提升抗肿瘤治疗的疗效,甚至有助于解决转移性肿瘤等难题。通过基因工程技术,从基因水平上调控细菌的分子机制来定制其生物功能,高效递送各种免疫治疗剂至肿瘤病灶处而发挥作用,达到精确调控、有效激活的目的,这是其他药物传递系统所无法比拟的。此外,肿瘤靶向型细菌介导的治疗方案既可作为单一疗法应用,也可与其他治疗方式如化疗、放疗和光热治疗等联合,以获得更佳的临床治疗结果。因此,该文主要讨论了活细菌发挥肿瘤靶向性和抗肿瘤免疫作用的关键,总结了生物工程菌用于免疫治疗的相关研究及其与其他治疗方式联合应用的优势,为细菌疗法的进一步研究与发展提供依据。     

沙门氏菌减毒及其作为疫苗活载体的研究进展

鉴于目前减毒沙门氏菌的研究日益引起人们的重视,从沙门氏菌减毒研究进展、减毒沙门氏菌疫苗活载体的构建、减毒沙门氏菌侵入及其携带外源基因诱导免疫应答的机制和减毒沙门氏菌疫苗活载体的应用等方面进行了系统地阐述,旨在为减毒沙门氏菌更深入的研究提供参考。     

稳定携带山羊痘病毒DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建

为构建质粒稳定型山羊痘DNA疫苗,采用PCR与限制性酶切技术去除真核表达质粒pcDNA3.1(+)的氨苄抗性bla基因启动子序列,构建改良质粒pmcDNA3.1(+),然后插入山羊痘病毒P32基因,获得重组表达质粒pmcDNA3.1-P32,通过TSS法将其转化至减毒沙门氏菌中,构建成功携带山羊痘DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌SL7207(pmcDNA3.1-P32);体内和体外试验结果表明,重组质粒pmcDNA3.1-P32在沙门氏菌中的稳定性显著高于pcDNA3.1-P32。这为下一步减毒沙门氏菌介导的山羊痘DNA免疫研究奠定了基础。     

肠炎沙门氏菌ssrAB、hilA、hilD基因缺失菌株的构建及其生物学特性

【背景】沙门氏菌(Salmonella)是重要的人畜共患病原菌,由于耐药菌株的不断出现,新型防治方法的研究迫在眉睫。【目的】探究ssrAB、hilA、hilD基因对肠炎沙门氏菌致病作用的影响,筛选安全可靠的沙门氏菌减毒活疫苗或载体用菌株。【方法】采用自杀性质粒介导的同源重组技术,分别构建ssrAB、hilA、hilD单基因缺失株(ΔssrAB、ΔhilA、ΔhilD)、双基因缺失株(ΔssrABhilA、ΔssrABhilD、ΔhilAhilD)和三基因缺失株(ΔssrABhilAhilD),并比较上述缺失菌株与亲本菌株间生物学特性的差异。【结果】基因缺失后菌株的生长速率无显著变化(P0.05);除ΔhilD生物膜形成能力最强外,其他基因缺失菌株生物膜形成能力变化不显著(P0.05);ΔssrABhilAhilD和ΔssrABhilA的LD50值最高,ΔssrAB、ΔhilA、ΔhilD次之;亲本菌株引起的小鼠十二指肠的病变程度较所有缺失菌株明显严重;在所有缺失菌株中,ΔssrABhilAhilD对HeLa细胞的黏附力最低,ΔhilD在小鼠体内的定殖率最高;而机体分泌IL-1、IL-18、IFN-γ的能力与沙门氏菌ssrAB、hilA、hilD基因无显著相关性(P0.05)。【结论】构建的7株基因缺失株中,ΔssrAB、ΔhilA、ΔhilD、ΔssrABhilA和ΔssrABhilAhilD有致病力低、生长速率良好、能有效刺激细胞因子产生等特性,具备作为沙门氏菌减毒活疫苗或载体的潜质。     

作为疫苗和疫苗载体的减毒细菌

减毒细菌不但能作为疫苗,而且已被证实是理想的疫苗载体,尤其是在研制基因工程疫苗方面显现了独特的优越性,减毒细菌作为载体可激发强烈的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫。主要就沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特菌和BCG等细菌作为疫苗和疫苗载体的研究进展进行综述,以期为新型疫苗的研制奠定基础。     

以减毒沙门氏菌为SARS-CoV N DNA口服疫苗载体的初步研究

目的:以减毒沙门氏菌为载体运送SARS-CoV N DNA疫苗至小鼠体内,研究其诱导的免疫应答情况,评价减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服疫苗的免疫效果。方法：将含SARS-CoV N基因的pcDNA-N质粒导入减毒鼠伤寒沙门氏菌CS022中,采用口服和滴鼻相结合的方法免疫BALB/c小鼠,以ELISA检测不同时间免疫小鼠血清中抗体及其亚型;以MTT法测定特异性淋巴细胞增殖反应;ELISPOT检测细胞因子;流式检测T细胞亚型。结果：pcDNA-N DNA疫苗口服免疫后2周就可以诱生特异性IgG抗体,且以IgG2a占优势;诱导了较高水平的淋巴细胞特异性增殖反应和IFN-γ,主要以Th1免疫为主。结论：减毒沙门氏菌可以有效运送pcDNA-N重组质粒并诱导产生特异体液和细胞免疫应答,为减毒细菌作为DNA疫苗运送载体的研究提供了参考依据,也为SARS疫苗研究开辟了新方法。     

鼠伤寒沙门氏菌asd基因的克隆及序列分析

以鼠伤寒沙门氏茵标准株基因组DNA作为模板,用PCR的方法扩增鼠伤寒沙门氏菌的asd基因并克隆入质粒pUCl9,并对其进行测序,序列与献报道一致。同时将质粒pYA248上的链球菌asd基因进行了置换,观察了分别含有链球菌asd基因与鼠伤寒沙门氏菌asd基因的质粒在减毒鼠伤寒沙门氏菌X4072中的生长情况,结果表明含有鼠伤寒沙门氏菌的asd基因的高拷贝质粒pUCl9的菌株生长情况更好。为完善染色体／质粒平衡致死系统,构建减毒鼠伤寒沙门氏活菌疫苗奠定了基础。     

重组质粒在减毒沙门氏菌中的稳定性及其对细菌侵袭力的影响

将含有外源基因的重组真核表达质粒pcDNA3-F和pCI-F转化减毒鼠伤寒门氏菌,探讨质粒类型和插入片段对重组质粒在细菌内的稳定性和细菌侵袭力的影响。结果表明,外源质粒可降低减毒沙门氏菌在体外的增殖能力和侵袭力,也影响细菌在鸡体内的存活力;就质粒类型而言,pCI的影响大于pcDNA3,而以携带外源基因的重组质粒影响较为显著;外源基因插入也影响质粒在宿主菌内的稳定性。提示利用减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗研究时,要考虑质粒类型与其在宿主菌内稳定性的关系、携带外源基因重组质粒对载体菌侵袭力和存活力的影响等问题。     

细菌作为抗肿瘤剂的研究进展

厌氧和兼性厌氧细菌能够专一性地优先累积在肿瘤的低氧量和坏死的区域,这使其具有很好的靶向性。它们能够分泌毒素或水解酶以及引起针对肿瘤的免疫反应,具有溶瘤作用。基因工程技术能够改造这些细菌使其具有抗肿瘤的特性,进一步增加治疗效果。最新的研究发现,这些细菌的某些代谢产物也具有增强肿瘤治疗效果的作用,为肿瘤的治疗提供了新的思路。本文对细菌作为抗肿瘤剂的相关研究进行综述。     

以减毒沙门氏菌作为重组疫苗载体的研究进展

用减毒沙门氏菌作为重组疫苗的载体具有安全、免疫方式类似自然感染途径等优点,有关研究日益广泛,可供作肠道疾病及多种细菌、病毒及真核微生物疾病重组疫苗的研制。本文介绍常用沙门氏菌载体的种类、表达及应用现状和有待克服的问题。     

以ErbB受体为靶向的融合蛋白抗肿瘤治疗研究进展

ErbB受体介导的信号转导途径对外胚层来源的肿瘤的增殖、浸润、转移、及血管新生起促进作用。因此,出现了针对ErbB受体信号转导途径各环节的不同的抗肿瘤治疗策略,包括抗ErbB受体的单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂等,而ErbB受体介导的融合蛋白因其高选择性引起人们的重视。主要探讨了具有抗肿瘤作用的以ErbB受体介导的融合蛋白在组成和细胞毒性方面的研究进展。     

口服携带人PF4基因的减毒沙门氏菌对大剂量化疗小鼠的促造血重建作用

目的:探索口服携带人PF4基因的减毒沙门氏菌对大剂量化疗小鼠造血重建作用。方法:通过在大剂量化疗前／后喂服携带PIRES2-EGFP／PF4减毒沙门氏菌,检测化疗后小鼠的生存率,小鼠在不同时间外周血血常规、骨髓细胞数、骨髓中Sca-1和C-kit细胞含量、不同时间骨髓生成各系细胞的集落数等。结果:在大剂量化疗前、后均口服携带PIRES2-EGFP／PF4减毒沙门氏菌组小鼠生存率高于只在化疗前口服携带PIRES2-EGFP／PF4减毒沙门氏菌组;两组口服携带PIRES2-EGFP／PF4减毒沙门氏菌组小鼠存活率明显高于PBS对照组及携带空载体的减毒沙门氏菌组;口服携带PIRES2-EGFP／PF4减毒沙门氏菌组小鼠在化疗后第9~12天的外周血血小板数、骨髓细胞中Sca-1和C-kit阳性细胞含量明显比对照组高,第5天、9天、12天的骨髓细胞总数、骨髓细胞形成Mix集落数明显增加。结论:口服减毒沙门氏菌SL3261为载体的PF4基因可以保护小鼠免受损伤,并促进化疗损伤小鼠的造血恢复。