用离体成熟的个别花粉进行活体受精

体外培养的经遗传工程转化的孤立花粉粒可用于完整植株胚珠的受精,这为不能从体外培养再生成株的植物提供了一种新的遗传工程方法,然而,目前尚未证明花粉粒经体外发育后能在活体内充分起作用,并不受花药的影响。这一点已得到奥地利维也纳大学的R.M.Benito Moreno等人的证明。他们在烟草植株发育的三个阶段,即后期的单核阶段。早期的二核阶段和中期的二核阶段分离出未成熟花粉,然后进行离体培养。他们在发芽培养基中获得了能产生花粉管的     

Advances in Pollen Mediated Genetic Transformation

植物遗传转化技术是植物科学基础理论与应用研究的有力武器,已成为植物遗传改良的重要途径之一。但是、目前遗传转化所采用的受体系统,大都需要体外培养和植株再生过程,才能获得转基因植株。其中、基因型限制和遗传变异是该技术不可逾越的两大障碍。花粉管通道法可省去转化体的离体培养,不过、多数植物受花器结构的限制而难以经花柱注射ＤＮＡ,只能向子房注射,并不是真正的“花粉管通道”。又由于此法外源基因的导入发生在授粉之后,因此该方法亦不属于花粉遗传转化。利用小孢子胚胎发生体系进行遗传转化与利用花粉作为外源ＤＮＡ的媒介,继而、通过授粉受精获得转基因种子,是目前花粉遗传转化的两个重要方面和活跃的研究方向。前者仍需要离体再生系统,后者则可以利用植物自身的再生机制,本文称之为花粉介导法（ｐｏｌｅｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）。该方法通过自然的胚胎发育过程获得转基因子代,避免了组织培养过程中的遗传变异和转基因植株的嵌合现象。可望成为简便快速的植物遗传转化体系。目前对花粉介导的遗传转化进行专门评述的文献较少,本文对该领域的研究分三个层次进行了综述。一、外源基因转化方法小孢子或由小孢子形成的胚状体是很有潜力的遗传转化受体     

小麦多重授粉及其在育种上的应用

达尔文在他的著作中曾描述过一定数量的花粉粒在完成植物授粉过程的重要作用。他介绍赫尔纳锦葵授粉限量试验是很有趣的,赫尔纳在锦葵雌蕊上逐渐增加花粉粒的数量,或者象他说的必需用花粉粒喂饱了雌蕊,才能使锦葵受精成功。这个事实井没有引起以后学者们足够的重视。1898年,纳瓦兴在研究了欧百合和嫩贝母的细胞胚胎之后,提出了植物双受精的见解,虽然在他的受精细胞研究工作中也曾看到除双受精以外同时进入胚囊的其他雄核的事实,他也只是看到而没有认识到这一现象在受精和遗传上的作用,并把它看成一种偶然现象。从此大家都把植物的     

根癌农杆菌介导的乙肝表面抗原基因对烟草的转化

构建了植物表达载体pBRSAg,该载体具有完整的植物表达元件,CaMV35S启动子、农杆菌T-DNA左右边界、植物报告基因gus和植物选择标记基因hpt,适用于农杆菌的转化;通过冻融法将重组质粒pBRSAg转入根癌农杆菌LBA4404中,利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,经筛选培养获得烟草植株。抗性植株经GUS染色和PCR检测为阳性,初步表明乙肝表面抗原基因在烟草中得到表达。     

PEG法介导转化诸葛菜下胚轴原生质体获得转基因植株

采用诸葛菜无菌苗的下胚轴组织为材料,分离原生质体,在原生质体培养基中作液体浅层暗培养,植板率为５％,植株再生频率为１００％。作者进而开展了遗传转化研究。为研究ＰＥＧ介导转化诸葛菜原生质体的影响因素,通过瞬间表达,实验了ＰＥＧ法转化子叶原生质体的过程,在此基础上将分离纯化后的原生质体与带ＨＰＴ基因的质粒ＤＮＡ（ｐＢＩ２２２）混合,ＨＰＴ基因作选择标记,ＰＥＧ介导转化;重新收集转化后的原生质体,以５×１０４／ｍｌ的密度在原生质体培养基中作浅层培养;培养１０—１５天后用２５ｍｇ／Ｌ的潮霉素（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）进行筛选,一月后出现少量细胞团,转入含潮霉素５０ｍｇ／Ｌ的扩增培养基扩增愈伤组织,进而转入含５０—１００ｍｇ／Ｌ潮霉素的分化培养基诱导分化成苗,分化率为１００％,转入生根培养基中生根成完整植株。抗性植株再生率为４×１０（－５）。在获得再生转基因植株后,以再生植株叶片为材料,进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分子杂交,证实外源基因已稳定整合到植物基因组中并表达,再生转基因植株频率为１０（－５）。国内外首次转化诸葛菜属植物原生质体获得成功。     

怀庆地黄胚珠试管受精的研究

怀庆地黄为自交系不亲和植物。为了克服其自交不亲和性,1978—1981年我们对其进行了胚珠试管受精研究,成功地克服了其自交不亲和的障碍,获得了试管受精的种子、幼苗和植株。试管受精所得的植株为二倍体。未授粉的带胎座的胚珠未形成种子和植株。完整雌蕊进行离体自花授粉,不能克服其自交不亲和性。通过胚珠试管受精,可消除雌性孢子体的柱头和花柱对花粉萌发和花粉管生长的抑制作用。     

油橄榄授粉受精和胚胎发育过程观察

该研究以油橄榄“鄂植-8”为材料,应用压片荧光观察花粉在柱头和花柱中的萌发及生长情况,采用石蜡制片法观察油橄榄的胚珠结构特点和授粉受精过程。结果表明：油橄榄为1子房2心室4胚珠,珠心较发达,由多层细胞构成,属于厚珠心椭圆型胚珠,胚珠直生;花开时花粉粒落到柱头上立刻萌发,随后花粉管在花粉通道中生长,再后进入子房经子房内表面,大部分花粉管不能到达胚珠,仅少数沿胎座生长经珠柄进入珠孔,释放2个精子,2个精核分别进入卵细胞和极核,并与卵核及极核相互融合;观察到合子中雌、雄性核仁融合的过程。授粉受精各阶段经历的时间为花粉落到柱头上立刻萌发;授粉后6d左右,花粉管长入胚珠的珠孔,随后释放精子;10 d左右完成授粉受精,30 d左右形成心型胚,40 d左右胚发育几乎成熟。在进行子房石蜡切片中,共观察到612个完整子房切片,发育完整的子房为97.53％,完成授粉受精的胚珠为15.52％。油橄榄在自然授粉下,约85％的胚珠授粉受精过程不能完成,在一定程度上影响其坐果。该研究结果为油橄榄授粉受精、高效生产等提供了理论依据。     

基因枪轰击成熟花粉粒转化玉米的研究

利用基因枪轰击花粉粒再授粉的基因转化途径,将豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（CpTI）成功导入玉米受体中。经卡那霉素筛选结果表明,非转化植株经1000ppm卡那霉素溶液处理后白化、死亡,余下大量健壮、可育的抗性植株,转化率约1．59％。通过对抗性植株进行PCR和PCR—Southern检测,初步确定CpTI基因已导入玉米基因组。饲虫实验结果表明转化植株具有较强的抗虫性。     

植物原生质体培养方法

1　植物原生质体培养的简史植物细胞原生质体 ,在植物学上指植物细胞通过质壁分离后 ,可以和细胞壁分开的那部分细胞物质。原生质体分离纯化后 ,须在适当的培养基上应用适当的培养方法 ,才能再生细胞壁 ,并启动细胞持续分裂 ,直至形成细胞团、长成愈伤组织或胚状体、分化和发育成苗 ,最终再生完整植株。其中 ,选择合适的培养方法始终是原生质体培养中最基础也是最关键的一环。植物原生质体培养方法起源于植物单细胞培养方法。早在 190 2年 ,Haberlant通过实验就预言 :体外培养单个细胞可通过其分裂得到培养组织。直到 1954年 ,植物单细胞培…     

小麦恢复可育基因非配子融合的转移

由于利用了根癌农杆菌作为载体的DNA 转移系统,高等植物中的双子叶植物基因转移 获得了成功。但根癌农杆菌的天然寄生范围仅 限于双子叶植物,因此,单子叶植物的转化尚待 探索其他途经。有人采用单细胞或原生质体摄 取外源DNA,再生成愈伤组织,进而培育成完 整植株‘”。有人为了避开从细胞培养成植株的 某些困难,设想采用配子作为接受外源DNA的 受体,在体外培养花粉,把精子作为显微注射 DNA的靶子,再由花粉管进人子房,通过受精 将外源遗传物质引人到合子,从而形成转化的 胚,再发育为转化的植株［[91。还有人设想,以雌 配子作为显微注射DNA的靶子,将外源DNA 直接注射入卵细胞,然后通过受精,使外源DNA 进人受精卵,发育为转化的胚及转化的植 株^[2,3,5,4,10]。此外,最近有人报道,已经重组了 Ti质粒,可在单子叶植物玉米中作为外源DNA 转移的载体L川。但在单子叶植物的禾本科农作 物中,如小麦、水稻、玉米等,至今仍缺少可行的 外源基因转移技术。     

花粉原生质体培养中的两条发育途径:细胞分裂与花粉管生长

花粉原生质体是植物生殖系统中一种新的实验体系,在植物实验生殖生物学与细胞工程应用方面均有重要价值。花粉原生质体培养可能有两条发育途径:继续体内配子体发育和通过脱分化转向孢子体发育,二者均有重要的应用前景:前者可用花粉原生质体进行授粉、受精、结实;后者可由花粉原生质体培养再生植株。     

花粉管通道法转基因技术的细胞胚胎学机理探讨

本文从细胞胚胎学出发,从理论上对花粉管通道、花粉管通道法的转化机理进行了研究。认为,外源DNA进入胚囊的途径,即外源DNA沿着连接柱头与胚囊的花粉管外界面渗入胚囊;外源DNA转化的受体应为合子;外源DNA转化的时期应限定在精卵融合至合子分裂前这一段时期,此时合子细胞壁尚未封闭;外源DNA转化受体的机制可能是外源DNA与处于原生质体状态的合子的随机融合。强调在应用此方法时,应对植物雌蕊结构以及受精经历的时间有全面了解,并列出了一些重要植物授粉后受精过程各阶段的时间,对外源DNA导入部位和方法提出了建议,并分析了花粉管通道法转基因技术转化率较低的原因。     

植物的试管受精实验

所谓植物的试管受精,是指在离体条件下进行人工传粉、受精、并进一步培育成正常植株的技术。 1960年,印度德里大学的植物学教授Kanta,将罌粟的无菌花粉注射入离体培养的罂粟子房内,获得了正常的“试管植株”,第一次实现了植物的离体受精。两年后,Kanta及其同事进一步在试管内对罌粟的离体胚珠进行直接地授粉获得成功。此后,植物的试管受精技术得到了较迅速的发展,二十年来,已有三十多种植物在试管内受精成功,其中有二十多种植物受精后发育成正常的试管植株,包括自交不亲和性植物的自交受精和种属间的远缘杂交受精。植物的试管受精,在国内也开展了一些研究工作,已取得了一些可喜的成果。首先于1977年,在玉米中获得了体外受精的成功,这是世界上首次在禾本科植物内试管受精成功。随后,在烟草、小麦与黑麦的杂交中获得了成     

大白菜(Brassica pekinensis)与甘蓝(B.oleracea)的种间试管受精

通过大白菜胚珠与甘蓝花粉的试管授粉和受精得到了杂种种子。杂交一代的植株形态和花粉发育情况及根尖细胞染色体数均表明为种间杂种。杂种植株具有父母本的特征,某些性状介于双亲之间;花粉粒发育不正常;根尖细胞染色体数为2n=19。本研究为其他十字花科植物的远缘杂交中克服不亲和性提供了依据。     

侧金盏花双受精进程研究

应用荧光显微镜和常规石蜡切片观察侧金盏花(Adonis amurensis)花粉管生长和受精作用的全过程。结果表明,侧金盏花为湿型柱头,授粉后1–2小时,花粉粒与柱头识别;授粉后2–4小时,花粉粒萌发;授粉后4–6小时,花粉管进入柱头。侧金盏花的受精模式为珠孔受精,授粉后10小时,精子被释放;授粉后30小时,精核与卵核融合;授粉后7天合子形成;授粉后15天合子进入分裂期,合子休眠期为8天。2个极核在受精前不融合,授粉后14–16小时,精核与1个极核融合;授粉后20–22小时,受精极核与另1个极核融合形成初生胚乳核。双受精作用属于有丝分裂前配子融合型。通过实验确定了侧金盏花受精过程的雌雄性细胞融合形态变化与相应经历的时间及其合子休眠期。研究结果丰富了侧金盏花胚胎学资料,对其今后的育种及转基因研究具有重要意义。     

利用微束激光穿刺法将抗真菌基因导入棉花的研究初报

以棉花感受态萌动种胚作为外源基因转化的受体,用激光微束穿刺法将β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶双价基因导入棉花,所构建的植物表达载体pB IBGC携带有筛选标记npt-Ⅱ(新霉素磷酸转移酶)基因。激光转化处理的种胚经卡那霉素筛选,已经获得抗性小植株。研究了微束激光转化法用于棉花感受态萌动胚转化预培养的时间、高渗液对材料的处理等。研究表明:用微束激光转化处理种胚是一种操作简便、重复性好的转化方法,用该法可将外源基因导入植物感受态萌动胚,避开植株离体再生的困难。     

高等植物离体受精的重大进展

最近,德国的马克斯普朗克育种研究所的一个实验室,成功地用分离的玉米精细胞和卵细胞在体外融合,产生了人工合子。这是植物生殖细胞工程的一次重大突破。在50年代,著名植物胚胎学家P.Maheshwari在总结被子植物受精作用的控制时,尚难以想象雌雄配子可以进行体外操作,并实现融合。至六十年代,在组织培养技术蓬勃发展的影响下,发展了将胚珠或子房在离体培养的条件下进行授粉和受精的方法,称为“试管受精”,后来也常称为“离体受精”。这是1962年在印度德里大学植物胚胎学实验室开创的。试验的成功当时引起了国际上很大的重视。在其后的十余年中,在这个领域内开展了不少的研究,表     

利用有性途径的植物转化

近年来 ,植物基因工程技术取得了重要进展 ,在农作物品种改良和育种方面发挥越来越重要的作用。然而 ,目前植物遗传转化所采用的受体系统 ,大都依赖于细胞组织培养技术才能获得转基因植株。其中 ,基因型限制和遗传变异是限制该技术发展和应用的两大障碍。因此 ,一些研究者试图避开组织培养和植株再生过程 ,利用植物有性生殖途径进行转化 ,并取得了一系列成果。这些方法包括以下方面 :(1 )利用花粉粒或花粉管作为转化DNA的载体 ;(2 )将外源DNA导入子房或胚珠中 ;(3 )以精、卵细胞、合子作为转化受体。这些方法利用了高等植物的有性生殖机制和胚胎发育过程 ,避免了无性繁殖过程中的遗传变异、植株再生困难及转基因植株嵌合等问题。该文归纳综合了该研究领域所取得的成果和最新进展 ,并对这些方法进行了评价及其发展趋势进行了分析。     

拟南芥脂肪酸外运蛋白FAX1影响雄性生殖发育的机制

拟南芥(Arabidopsis thaliana)FAX1(fatty acid export 1)定位于质体内膜,向质体外运输从头合成的脂肪酸,FAX1突变显著降低了生物量和雄性育性,但FAX1影响植物雄性生殖的机制尚不清楚。我们通过花粉粒染色、正反交和花药半薄切片观察,发现FAX1突变延缓了绒毡层的降解,不但影响花粉壁发育和花粉育性,也影响授粉受精;通过GUS染色和q RT-PCR检测揭示了FAX1在花早期发育过程的表达上升模式;通过化学测定和扫描电镜观察发现FAX1突变还影响花器官表面结构的形成。综上所述,FAX1突变从多个方面影响植物雄性生殖发育。     

普通小麦与鸭茅状摩擦禾的远缘杂交 Ⅲ受精和早期胚胎的发育

用石蜡制片法和整体解剖法,对小麦品种Ｆｕｋｕｈｏ经鸭茅状摩擦禾花粉授粉后不同时间固定的子房样品进行了细胞胚胎学观察。结果表明,观察的１６８个授粉后１２０小时（５天）以内的小麦子房中有３２１％、０６％和２６２％分别发生了卵细胞单受精、极核单受精和卵细胞、极核双受精现象。发生卵细胞受精、极核受精和总受精频率分别为５８３％、２６８％和５８９％。对１１６个授粉后９天的小麦子房进行整体解剖,检测到有５００％的子房有幼胚。报道了小麦与鸭茅状摩擦禾杂交的受精过程和早期胚胎发育的情况。为小麦与鸭茅状摩擦禾杂交提供了高频率受精和胚形成的细胞胚胎学证据。