IL2-TNFα基因诱导大鼠C6胶质瘤细胞凋亡

目的为深入进行胶质瘤细胞凋亡的分子生物学研究及为提高胶质瘤辅助免疫治疗打下基础.方法通过光镜、电镜、荧光显微镜分析,DNA断裂分析及流式细胞仪分析,进行通过IL2-TNFα诱导C6胶质瘤细胞凋亡研究.结果本研究用脂质体将pLXSN-IL2-TNFα基因导入病毒包装细胞PA317,经G418抗性筛选,用NIH3T3细胞测得病毒滴度为5×10\+5CFU/ml的细胞克隆,利用病毒上清感染C6细胞,测得IL2的生物活性为2.0～8.0U/10\+6cells/24h,测得TNFα生物活性为3～110U/10\+6cells/24h,实验证实在作用72h后,C6细胞出现细胞凋亡;光镜和电镜可见细胞形态学上出现细胞皱缩,染色质浓集贴边;流式细胞仪结果显示有凋亡峰出现,凋亡细胞占细胞总数14.0%±1.3%;荧光显微镜观察出现染色质浓集、断裂;DNA电泳表现出DNA呈梯状带断裂.结论上述结果提示用IL2-TNFα成功诱导大鼠C6胶质瘤细胞发生凋亡.     

改组猪IL-2和重组IL-6C基因增强猪口蹄疫疫苗的免疫应答

以离子交联法制备壳聚糖纳米颗粒,包裹重组改组的猪IL-2基因表达质粒(VRIL2S)、重组IL-6和CpG(VPIL6C)质粒(CNP-VRIL2S-VPIL6C-CNP), 按0.5 mg/头肌肉注射壳聚糖包装质粒接种21日龄健康三元杂交猪,同时肌肉注射免疫灭活口蹄疫疫苗;在免疫后7、14、28、42和56 d,采血检测实验猪的免疫球蛋白、特异抗体和免疫细胞的动态变化.结果发现:接种后56 d,改组猪IL-2和重组IL-6C质粒接种猪血液中的特异性抗口蹄疫抗体、IgG、IgA和IgM含量均较对照空白疫苗免疫猪显著升高(P<0.05),其IL-2、IL-6水平和淋巴细胞、单核细胞的数量也相应较灭活疫苗对照组明显增加(P<0.05).这些证明猪IL-2和IL-6基因与CpG有良好的免疫协同增强效应,能有效地增强疫苗的特异体液和细胞免疫应答反应,可作为安全高效的新型免疫基因分子佐剂,促进猪对口蹄疫疫苗的免疫防御抗病力,抵御口蹄疫的感染.     

IL-2与IL-7基因对犬细小病毒VP2 DNA疫苗在小鼠的免疫增强作用

[目的]探讨犬白细胞介素-2(cIL-2)与犬IL-7(cIL-7)基因对犬细小病毒(CPV) VP2蛋白DNA疫苗免疫增强的协同作用.[方法]利用含内部核蛋白体进入位点( IRES)的真核表达载体构建cIL-2和cIL-7双基因表达载体.然后利用本实验室构建的CPV VP2、cIL-2和cIL-7表达载体及本文构建的双基因表达载体,以不同组合对小鼠进行免疫,即VP2单免疫,VP2+cIL-2、VP2+cIL-7和VP2+cIL-2/cIL-7共免疫.通过ELISA方法检测免疫后不同时间小鼠血清VP2的抗体水平,并分析中和抗体的效价,通过细胞增殖实验检测免疫后小鼠脾脏淋巴细胞的增殖反应,并用ELISA方法测定小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平.[结果]本实验构建的双基因表达载体结构正确,并能够介导cIL-2与cIL-7基因在真核细胞中进行同步分泌表达.小鼠免疫结果表明,VP2+cIL-2/cIL-7共免疫组小鼠血清的抗体滴度和中和抗体效价均显著高于VP2 +cIL-2和VP2+cIL-7共免疫组(P＜0.05).VP2+cIL-2/cIL-7共免疫组小鼠的淋巴细胞刺激指数比其它免疫组略有升高但尚未达到显著水平,然而γ干扰素的表达水平显著高于其它免疫组(P＜0.05).[结论]cIL-2和cIL-7基因对CPV VP2 DNA疫苗免疫原性的增强作用具有明显的协同效应.     

人IL-2/IFNα2b融合基因在肝癌细胞中靶向表达

 根据细胞因子之间协同作用的特点,采用重组 Ｄ Ｎ Ａ 技术设计并构建了人 Ｉ Ｌ ２ 与 Ｉ Ｆ Ｎα融合基因,并用肝癌组织特异的 Ａ Ｆ Ｐ增强子／ Ａ Ｌ Ｂ启动子调控融合基因在肝癌细胞中的靶向表达．实验结果表明,克隆的 Ｅ Ａ Ｆ Ｐ Ｐ Ａ Ｌ Ｂ联合转录调控序列能调控细胞因子基因在 Ａ Ｆ Ｐ阳性人肝癌细胞中靶向表达, Ｉ Ｌ ２／ Ｉ Ｆ Ｎα２ｂ 融合基因的表达水平与感染肝癌细胞的 Ａ Ｆ Ｐ表达水平呈正相关性．实验证明表达的融合蛋白具有 Ｉ Ｌ ２ 和 Ｉ Ｆ Ｎ 两种生物学活性的细胞因子．这可能为肝癌基因治疗开辟新途径．     

IL-2与金黄色葡萄球菌肠毒素A和B融合基因的克隆及表达

目的：IL-2与金黄色葡萄球菌肠毒素A和B融合基因的克隆及表达。方法：分别在金黄色葡萄球菌肠毒素A227Ala、B基因的两端克隆上两个酶切点Hind Ⅲ,Kpn Ⅰ。将IL-2基因突变,设计一段linker使之分别与SEA227Ala和SEB相连并克隆到PET表达载体中,在大肠杆菌DH5a（DE3）-Pass中表达。结果：表达的蛋白占总蛋白15%。结论：IL-2与金黄色葡萄球菌肠毒素A和B融合蛋白能在大肠杆菌中有效表达。     

IL-2与猪细小病毒VP2基因双表达载体的构建及免疫原性的研究

将白细胞介素-2基因和猪细小病毒VP2基因主要抗原区克隆至pCI-neo真核表达载体中,构建了pCIneo-IL2-VP2重组质粒,用脂质体将其转染到PK-15细胞中,利用免疫荧光方法检测在体外表达情况。并以小鼠为动物模型,将pCIneo-IL2-VP2重组质粒、对照组pCI-neo和猪细小病毒活疫苗通过肌肉注射进行免疫,检测免疫小鼠的淋巴细胞转化功能,特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果显示,pCIneo-IL2-VP2在体外能够诱导PK-15细胞表达VP2蛋白,小鼠注射pCIneo-IL2-VP2质粒1周后能够诱导机体产生抗体,4周时达到峰值,与活疫苗对照组产生的抗体滴度、诱导T淋巴细胞增殖和诱导强的细胞毒性基本一致。试验表明,构建的pCIneo-IL2-VP2能够有效诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。     

Visfatin、IL-6、TNF-α与2型糖尿病的相关研究

目的:探讨血浆visfatin、IL-6、TNF-α与2型糖尿病的关系。方法:2型糖尿病患者60例,正常对照组30例。根据体重指数分为肥胖组和非肥胖组。检测空腹血浆胰岛素、糖化血红蛋白、血糖、血脂、血压、visfatin、TNF-α、白介素-6等。计算体重指数、腰臀比值及稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。结果:2型糖尿病组血浆visfatin、IL-6、TNF-α水平显著高于正常对照组(P<0.05);2型糖尿病组与正常肥胖组比较,糖尿病非肥胖组visfatin(301.60±58.07)明显升高,糖尿病肥胖组visfatin(336.68±37.61)、TNF-α(3.58±1.10)明显升高(P<0.05)。多元线性相关分析表明,在肥胖的2型糖尿病患者中血浆TNF-α与糖化血红蛋白显著正相关,血浆IL-6与血糖(FPG)显著正相关,血浆visfatin与腰臀比值(WHR)显著正相关(P<0.05)。结论:visfatin、IL-6、TNF-α的变化可能对2型糖尿病的发生、发展具有一定的作用。     

Visfatin、IL-6、TNF-α与2型糖尿病的相关研究

目的：探讨血浆visfatin、IL-6、TNF-α与2型糖尿病的关系。方法：2型糖尿病患者60例,正常对照组30例。根据体重指数分为肥胖组和非肥胖组。检测空腹血浆胰岛素、糖化血红蛋白、血糖、血脂、血压、visfatin、TNF-α、白介素-6等。计算体重指数、腰臀比值及稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。结果：2型糖尿病组血浆visfatin、IL-6、TNF-α水平显著高于正常对照组（P〈0.05）;2型糖尿病组与正常肥胖组比较,糖尿病非肥胖组visfatin（301.60±58.07）明显升高,糖尿病肥胖组visfatin（336.68±37.61）、TNF-α（3.58±1.10）明显升高（P〈0.05）。多元线性相关分析表明,在肥胖的2型糖尿病患者中血浆TNF-α与糖化血红蛋白显著正相关,血浆IL-6与血糖（FPG）显著正相关,血浆visfatin与腰臀比值（WHR）显著正相关（P〈0.05）。结论：visfatin、IL-6、TNF-α的变化可能对2型糖尿病的发生、发展具有一定的作用。     

rmhTNF-α联合抗IL-6抗体对胃癌SGC-7901细胞杀伤作用的研究

目的：研究rmhTNF-α联合抗IL-6抗体对胃癌SGC-7901细胞的杀伤作用。方法：（1）将已培养的SGC-7901细胞株分为a、b、c、d、e组,a、b、c、d组分别加入浓度为10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml的rmhTNF-α,e组加入等量PBS。ELISA检测不同时间点SGC7901细胞上清液中IL-6的分泌量,MTT法检测细胞培养24 h、32 h、40 h、48 h的凋亡情况。（2）将SGC-7901细胞分为f、g、h、i组,f组加入rmhTNF-α,浓度分别为10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml;g组加入不同浓度的rmhTNF-α与浓度为100 ng/ml的IL-6,h、i组加入不同浓度的rmhTNF-α与浓度分别为1：62.5和1：125的抗IL-6抗体。MTT法测细胞培养48 h的凋亡情况。荧光显微镜观察细胞凋亡情况。结果：（1）IL-6分泌五组差别具有统计学意义（P〈0.05）,a、b、c、d组IL-6浓度均高于e组（P〈0.05）,a、b、c组相比各时间点IL-6浓度逐渐升高（P〈0.05）,c、d组差别无统计学意义。（2）细胞存活率a、b、c、d组与e组差别具有统计学意义（P〈0.05）,a、b、c、d组内比较差别有统计学意义（P〈0.05）,显示杀伤作用40 h后减弱,c、d组差别无统计学意义。（3）细胞存活率f、g组比较差别具有统计学意义（P〈0.05）,h、i组与f组差别有意义（P〈0.05）,h、i组比较,i组细胞存活率较低。结论：rmhTNF-α可以促进SGC-7901细胞分泌IL-6;抗IL-6抗体可以增强rmhTNF-α对SGC-7901细胞的杀伤作用。     

肿瘤坏死因子-α和白介素-2对成骨细胞增殖的影响

成骨细胞在骨组织改建中至关重要。本试验体外培养人骨肉瘤细胞系MG63,MTT方法检测白介素-2(Interleukin-2,IL-2)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)对成骨细胞增殖的影响。结果表明,当IL-2的浓度大于100U/mL,其能够促进成骨细胞增殖(P0.05),一定浓度(50～1000U/mL)的TNF-α对成骨细胞的增殖也有促进作用。     

壳聚糖纳米包裹的IL-2与TpGpd核酸疫苗联合免疫后对Tp感染兔皮肤前后的免疫效应评估

梅毒是一种由梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)引起的临床表现复杂的性传播疾病,近年来世界各国包括中国的梅毒发病率呈逐年上升趋势,研制有效疫苗预防该种疾病已成为各国关注的公共卫生问题.DNA疫苗具有免疫效果好且持久、无毒力回复等特点成为近年来研究热点.对于Tp核酸疫苗研究,国内外除了本课题组构建TpDNA疫苗免疫新西兰兔进行免疫活性的初步研究外,尚未见Tp核酸疫苗的相关研究.本研究旨在探讨评价白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)与Tp膜蛋白GpdDNA疫苗用壳聚糖(chitosan,CS)纳米颗粒包裹联合免疫新西兰兔后对Tp皮肤感染后的保护效应.将真核表达重组体pcDNA3.1(+)/IL-2和pcDNA3.1(+)/TpGpd采用壳聚糖纳米颗粒包裹或未包裹方式处理后分别或联合免疫新西兰兔,每隔2周加强1次共免疫3次,并于初次免疫后第10周各实验组兔皮下接种Tp标准株进行背部皮肤感染实验,观察记录感染早期各实验组皮损的变化情况,在免疫及感染期间不同时间点ELISA检测免疫兔特异性抗体产生水平和脾细胞IL-2及IFN-诱导水平,MTT法检测兔脾细胞增殖水平.初步结果证实,pcD/IL-2基因佐剂可以显著加强pTpGpd疫苗在免疫期(0~8周)兔体内的特异性抗体及脾细胞增殖分化水平以及维持Tp感染后168天时间内长期稳定的高抗体水平及高脾细胞增殖分化水平.pcD/IL-2基因佐剂和CS纳米颗粒的联合使用对pcD/TpGpd疫苗的抗Tp皮肤感染的保护性效应达到最佳.     

人乳头瘤病毒16型E5与IL-12联合基因疫苗的免疫活性

为了研制人乳头瘤病毒16型(HPV16)防治性疫苗,分析了HPV16 E5与IL-12联合基因疫苗的免疫活性。将构建的pcDNA3.1(+)/E5与pcDNA3.1(+)/IL-12联合免疫BALB/c小鼠,以ELISA测定小鼠血清中抗HPV16 E5 IgG水平、小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4含量;MTT法检测脾淋巴细胞增殖反应。结果显示末次免疫后,联合基因疫苗组和单基因疫苗组血清IgG A450值分别明显高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组(P<0.01);且联合基因疫苗组显著高于单基因疫苗组(P<0.01)。联合基因疫苗组和单基因疫苗组的IFN-γ和IL-4含量分别均明显高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组IFN-γ和IL-4含量(P<0.01),且联合基因疫苗组含量显著高于单基因疫苗组(P<0.01)。联合基因疫苗组和单基因疫苗组脾淋巴细胞刺激指数(SI)分别显著高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组(P<0.01);联合基因疫苗组与单基因疫苗组比较,SI差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明HPV16 E5单基因疫苗以及与IL-12联合基因疫苗均能刺激机体产生较强的免疫应答,且联合基因疫苗优于单基因疫苗。     

携带EBV-LMP2基因的DNA疫苗、腺相关病毒疫苗和腺病毒疫苗免疫小鼠的特异性细胞免疫应答

细胞免疫应答, 尤其是CD3⁺CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL), 在控制病毒感染中扮演着重要角色. 鼻咽癌(nasopharyngenl carcinoma, NPC)与EB病毒(epstein-barr virus, EBV)持续感染密切相关, 在鼻咽癌疫苗的研究中, 人们将研究重点放在增强特异性抗病毒CTL应答上. 本研究单独或联合使用表达EB病毒潜伏膜蛋白抗原2(epstein-barr virus latent membrane protein 2, EBV-LMP2)的DNA疫苗、腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)疫苗、非复制5型腺病毒疫苗(Ad5), 分别于0, 2, 4周肌肉注射免疫4~6周龄的雌性Balb/C小鼠, IFN-γ 免疫斑点法检测EBV-LMP2特异性细胞免疫应答水平. 疫苗诱导的特异性细胞应答水平与疫苗的免疫策略有关. 其中, 使用3种载体疫苗联合免疫的效果最好, 其次则是先使用DNA疫苗免疫两次, 再用腺病毒疫苗加强免疫一次的联合免疫方法. DNA疫苗和AAV疫苗单独免疫能够诱导出特异性的CTL, 但与联合免疫相比诱导的应答水平很低. 结果表明, 使用DNA, AAV和腺病毒载体疫苗联合免疫, 能够更好地诱导机体产生特异性细胞免疫应答, 为鼻咽癌的防治提供了很好的疫苗策略.     

鸡GM-CSF和IL-2增强表达新城疫病毒F蛋白的重组杆状病毒疫苗的免疫效果

为比较鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)及鸡白细胞介素2(Interleukin 2,IL-2)对杆状病毒疫苗的免疫增强效果,通过基因工程手段构建重组杆状病毒疫苗(Recombinant Baculovirus,BV)rBV-LMI-F,并联合GM-CSF及IL-2进行鸡体免疫。对中和抗体水平及细胞因子含量比较GM-CSF和IL-2的免疫增强效果进行对比。结果显示,在第一次免疫28 d或42 d后,GM-CSF联合免疫组可诱导鸡体产生更高的抗体和细胞因子水平(P0.01)。表明鸡GM-CSF能更有效地刺激机体产生较强的抗体和细胞因子反应,提高重组杆状病毒疫苗的免疫效果。     

重组人α2a干扰素的高效表达与纯化

构建了人α2a型干扰素的表达载体,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量平均为10~ IU/L菌液。还对其表达产物进行了纯化。经盐酸胍裂解菌体、硫酸铵沉淀、酸化处理,再经阴、阳离子交换层析和单克隆抗体亲和层析,使表达产物纯化了1072倍,比活性达1.2×IO~ IU/mg蛋白,达到序列纯,回收率达54％。表达产物N端21个氨基酸序列分析结果与IFN-α2a cDNA推导的序列相符合。     

基于流感病毒HA柄部和M2e融合基因的DNA疫苗

由于流感病毒容易突变,流感通用疫苗的研究势在必行.流感病毒血凝素(HA)柄部和基质蛋白2的胞外域(M2e)都是流感病毒通用疫苗的重要候选靶点.通过重叠PCR的方法用A/PR/8/34(H1N1)(简称PR8)流感病毒的M2e或者4个甘氨酸取代HA的头部,分别获得HAM2e和HA4G,然后将两种重组基因插入真核表达载体pCAGGS-P7中,制得pHAM2e和pHA4G两种DNA疫苗.通过电击免疫的方法对小鼠分别免疫pHAM2e和pHA4G,免疫3次,每次免疫间隔2周.第3次免疫2周后用5LD50的同源流感病毒感染小鼠.结果表明HAM2e组和HA4G组的小鼠均产生了特异性抗体,HAM2e组比HA4G组具有更好的抗PR8流感病毒的能力,这提示可以用M2e替换HA头部用于疫苗研发.     

IL-13Rα2介导的毒素融合蛋白在肿瘤治疗中的应用

近年来IL-13受体IL-13Rα2的研究已经成为一个新兴热点,IL-13Rα2在许多肿瘤细胞细胞表面存在特异性高表达,而在正常组织中不表达或表达量很低,通过IL-13Rα2介导的毒素融合蛋白靶向治疗肿瘤也已成为肿瘤诊断和免疫治疗研究中的重要方面。随着对IL-13Rα-结构和功能及其与肿瘤关系研究的不断深入,将为肿瘤的靶向治疗提供新的思路,为肿瘤的临床治疗提供新的理论依据。对IL-13Rα2在不同肿瘤中的表达及IL-13和不同毒素融合得到的毒素融合蛋白在细胞和动物体内等不同水平上对肿瘤治疗的作用做出了相应概括,并对通过IL-13Rα2介导的毒素融合蛋白治疗肿瘤机理的研究以及融合蛋白方法改进及其它相关治疗方法等方面作出综述。     

HBV PreS2 S/IFN-α融合基因真核表达载体的构建及其表达

构建含HBVPrdS2 S和IFN α融合基因的真核表达载体pcDNA3.1.S2S/IFN α并在真核细胞中进行表达。应用重叠延伸剪切技术 (splicingbyoverlappingextension ,简称SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段S2S/IFN α ,回收后直接克隆到 pcDNA3.1V5 /HisTOPOTA克隆载体 ,得到真核重组载体pcDNA3.1.S2S/IFN α。然后用脂质体法转染VeroE6细胞。对重组载体进行了限制性酶切及PCR鉴定 ,证明连接正确 ;经间接免疫荧光检测证实该重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。真核表达载体pcDNA3.1.S2S/IFN α的成功构建及在VeroE6细胞中的有效表达 ,为进一步探讨HBV感染的特异性免疫治疗提供了实验依据     

聚乙二醇干扰素α-2a对慢性乙型肝炎患者树突状细胞B7-H1表达的影响

目的：观察聚乙二醇干扰素α-2a对慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞功能及B7-H1的影响,探讨慢性乙型肝炎病毒逃逸的的机制。方法：慢性乙型肝炎患者31例,给予聚乙二醇干扰素α-2a180txg抗病毒治疗52周,分别于0、12、26、52周检测肝功能、HBV-DNA;流式细胞术检测外周血mDC表面HLA-DR、CD80、CD86、CD83、CDla、B7一H1水平。根据患者HBV—DNA水平,将患者分为应答组（A组）、非应答组（B组）,10例健康志愿者作正常对照组（C组）。结果：慢性乙肝患者的树突状细胞膜表面分子HLA-DR、CD80、CD86、CD83、CDla的表达均降低。聚乙二醇干扰素α-2a治疗后应答组膜表面分子HLA-DR、CD80、CD86、CD83、cDla的表达高于非应答组65．3±6．2％VS44．2±5．5％,67．2±7．4％VS37.3±7．2％,68．4±3．6％VS42．5±7．3％,65．6±6．8％VS43．2±3．9％,49．4±9．5％VS37．5±7．9％,（P〈0．05）。应答组B7-H1表达水平较治疗前下降,非应答组B7-H1水平无明显变化12．73±3．8％VS25．24±2．92％,（P〈0．05）。结论：慢性乙型肝炎患者树突状细胞功能低下,聚乙二醇干扰素α-2a治疗可以提高树突状细胞功能,降低B7-H1表达,促进HBV-DNA的清除。树突状细胞功能低下及B7-H1高表达是乙型肝炎病毒免疫逃逸的因素之一。     

HBV PreS2＋S／INF—α融合基因真核表达载体的构建及其表达

构建含HBV PreS2 S和INF-α融合基因的真核表达载体HBV PreS2 S/INF-α并在真核细胞中进行表达,应用重叠延伸剪切技术（splicing by overlapping extension,简称SOE）经两次PCR获得嵌合基因片段S2S／IFN－α,回收后直接克隆到pcDNA3.1 V5/His TOPO TA克隆载体,得到真核重组载体pcDNA3.1.S2S/IFN-α然后用指质体法转染Vero E6细胞。对重组载体进行了限制性酶切及PCR鉴定证明连续正确;经间接免疫荧光检测证实该重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。真核表达载体pcDNA3.1.S2S/IFN-α成功构建及在Vero E6细胞中的有效表达,为进一步探讨HBV感染的特异性免疫治疗提供了实验依据。