百日咳抗体酶联检测试剂盒的研制及其应用

为了研制百日咳抗体酶联检测试剂盒以调查吉林省2~8岁儿童百日咳、白喉及破伤风抗体水平。采用百日咳菌液经硫酸铵盐析、PBS溶液浸提及蔗糖密度梯度离心提取的PT和FHA作为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗人IgG,作为抗体制备ELISA试剂盒。并经敏感性、特异性、重复性试验考查该试剂盒质量。结果显示,试剂盒敏感性可达0.0036 IU/m l;重复性较好,CV<4%。试剂盒置于37℃3d敏感性无明显变化。吉林省2~8岁儿童白喉、破伤风的抗体水平较高,百日咳的抗体水平相对较低。此方法制备的百日咳抗体酶联检测试剂盒的质量符合要求,可应用于临床检验与流行病学监测。     

酶联免疫吸附检测法的应用研究进展

酶联免疫吸附检测法(ELISA)由于具有灵敏、特异、简单、快速及易于自动化操作等优点而得到了快速发展,并且被广泛应用于多个领域.本文对ELISA检测法应用现状及优缺点进行综述,为今后ELISA检测法的更为广阔的应用与发展提供参考.     

儿童抗幽门螺杆菌IgG和IgA水平的酶联免疫吸附试验检测

目的：了解北京地区儿童幽门螺杆菌（Hp)的感染状况,探讨儿童幽门螺杆菌感染与年龄、性别的关系,比较分析HP感染后血清中抗体(IgG、IgA)水平。方法：采用ELISA方法对我院消化道门诊227例患儿同时检测血清抗Hp抗体IgG、IgA,任一项阳性者即诊断为Hp感染。结果：(1)227例门诊患儿Hp平均感染率53．7％,男孩感染率57．1％,女孩48．1％。(2)3岁以下就诊儿童Hp感染率57．1％,4—7岁组39．1％,8—12岁组60．5％,13岁以上47．1％;其中66．9％(81／120)的Hp阳性患儿在8—12岁之间;(3)HP感染总阳性率53．7％;若单独检测IgG,阳性率42．7％,假阴性率11％;单独检测IgA,阳性率22％,假阴性率31．7％;两项诊断符合率达57．3％。结论：北京地区儿童幽门螺杆菌感染率较高。有消化道症状伴HP感染的患儿以8—12岁居多,其感染率明显高于全国无症状儿童平均染率。儿童Hp感染性别差异无显著性,感染后血清抗体水平IgG显著高于IgA,同时检测IgG、IgA有助于提高ELISA方法Hp的感染检出率。     

酶联免疫吸附试验定量检测血清肝素酶方法的建立及应用

目的：建立一种简便、微创的血清肝素酶酶联免疫吸附（ELISA）定量检测方法,并对肿瘤患者和正常人血清肝素酶进行比较,初步探讨血清肝素酶水平与肿瘤发生、发展的关系。方法：选择鼠抗人肝素酶单克隆抗体和兔抗人肝素酶多克隆抗体,建立双抗夹心ELISA检测方法,并利用此方法检测健康献血者和肿瘤患者血清中的肝素酶水平。结果：组内数据稳定,可重复;肿瘤患者血清中肝素酶D450nm值高于健康献血者。结论：所建立的血清肝素酶ELISA检测方法灵敏、高效,可用于肿瘤的辅助诊断。     

一种新的无传染性的检测HBeAg抗HBe的单克隆酶联免疫吸附法(MonoLISA)的建立与应用

应用我室自1988年5月以来建立的抗乙型肝炎e抗原两个抗原决定簇的单克隆抗体,和在大肠杆菌中高效表达的乙型肝炎病毒e抗原,组装成检测HBeAg/抗HBe的酶联免疫试剂(简称Mo-noLISA)。测定了该试剂的特异性、敏感性和可重复性,并与用日本单克隆抗体和血清e抗原组装的类似的EIA试剂进行了比较。结果两种试剂检测92份乙肝病人血清e抗原和38份血清e抗体的总符合率,分别为97.8％和100％。用两种试剂同时滴定一份已知HBeAg阳往和一份抗-HBe阳性的血清,证明两者的敏感性无显著差异。重复性试验证实,该试剂的重复率为100％。由此证明,用抗-HBeMcAb和基因工程抗原组装的诊断试剂,特异性强,敏感性高,可重复性好,且无传染性。这不仅为诊断试剂原材料的更新提供了丰富的来源,而且将该类试剂提高到一个新水平。     

兔出血症抗体间接ELISA检测试剂盒的研制与初步应用

目的建立检测兔病毒性出血症(RHD)血清抗体的间接ELISA方法并组装成试剂盒,进行初步应用。方法通过差速离心和蔗糖密度梯度离心提纯RHDV病毒粒子作为包被抗原,优化反应条件和筛选试剂,建立间接ELISA检测方法,组装试剂盒并对其总体性能进行评价。结果试剂盒敏感性为血凝抑制试验的4~32倍,重复性和特异性良好,保质期为4℃3个月。对105份兔血清进行随机检测,与血凝抑制试验的复核率为95%。结论本试剂盒可以在检测和科研中初步应用。     

抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体的制备及双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测法的建立

目的：制备针对嗜肺军团茵血清8型的单克隆抗体,并建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法。方法：用甲醛灭活的嗜肺军团菌血清8型菌免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体,建立双抗夹心ELISA检测方法。结果：研制出8株能特异性分泌抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,Ig类型分别为IgM（2株）、IgG,（1株）和IgG,（5株）;利用IgG1型单抗6G10与6C7配对,建立了双抗夹心ELISA检测方法,该方法的最低检出浓度为2．6×10^5cfu／mL,除与金黄色葡萄球菌有微弱的交叉反应外,与14株其他血清型嗜肺军团菌、17株非嗜肺军团菌及11株非军团菌均无交叉反应,具有较高的特异性。结论：制备了具有高特异性和亲和力的抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体,并建立了双抗夹心EUSA检测方法。     

自制抗人磷脂酶A2受体抗体ELISA试剂盒的临床应用评价

旨在自制能够辅助诊断原发性膜性肾病的抗磷脂酶A2受体(PLA2R)抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测试剂盒;通过包埋HEK293细胞表达的重组抗原、患者血清与抗原反应、酶的催化放大效应测定样本中抗PLA2R IgG滴度,通过临床数据分析、与市售试剂盒的比对,评价该试剂盒的临床应用价值及性能。研究发现自制试剂盒与国外试剂盒检测阳性一致率97.2%,阴性一致率100%;检测限不高于2 RU/mL;准确度的测量相对偏差在±15%区间内;试剂盒线性范围在2–500 RU/mL,线性相关系数r值不低于0.990 0;重复性检测的变异系数(CV)小于15%;于37℃恒温箱放置1周后,2–8℃放置1年后,检测性能无明显改变。结果表明自制试剂盒对血清抗PLA2R抗体检测的敏感性、特异性均与德国欧蒙公司(E150522BD)试剂盒相近,诊断效能高,可用于原发性膜性肾病辅助诊断。     

抗RA33 抗体与幼年特发性关节炎的诊断意义

目的:通过检测幼年特发性关节炎(JIA)患者血清中的抗RA33抗体,了解抗RA33抗体与幼年特发性关节炎的临床诊断价值。方法:采用酶联免疫固相分析检测81例JIA患儿(女19名,男62名,平均年龄8.6岁,平均病程1.4年)血清中抗RA33抗体、RF,同时以55例儿童系统性红斑狼疮(SLE)等其他关节性疾病或病毒感染患者和49例健康儿童作为对照组。阴阳性结果判断均采用试剂盒推荐的临界值。结果:81例JIA患儿中抗RA33抗体阳性率为11.11%(9/81),RF阳性率为12.35%(10/81),特异性均为91.35%;JIA组与正常对照组抗RA33抗体阳性率比较有统计学意义(P<0.05),与其他关节性疾病对照组比较差异无显著性(P>0.05)。JIA组中抗RA33抗体的检出与RF无相关性(P>0.05);在JIA各亚型中抗RA33抗体主要存在于全身型和多关节型,各占33.3%和25.0%,RF则只出现于多关节型,占62.5%。两者比较有显著性差异(P<0.05)。81例JIA患儿中共有18例关节出现影像学改变,其中4例抗RA33抗体阳性(22.2%),与未发生影像学改变的JIA患儿比较无显著性差异(P>0.05)。结论:抗RA33抗体尚不能作为JIA早期诊断的新的可靠性指标,抗RA33抗体主要见于全身型和多关节型,对JIA的分型有指导意义。     

抗RA33抗体与幼年特发性关节炎的诊断意义

目的：通过检测幼年特发性关节炎（JIA）患者血清中的抗RA33抗体,了解抗RA33抗体与幼年特发性关节炎的临床诊断价值。方法：采用酶联免疫固相分析检测81例JIA患儿（女19名,男62名,平均年龄8.6岁,平均病程1.4年）血清中抗RA33抗体、RF,同时以55例儿童系统性红斑狼疮（SLE）等其他关节性疾病或病毒感染患者和49例健康儿童作为对照组。阴阳性结果判断均采用试剂盒推荐的临界值。结果：81例JIA患儿中抗RA33抗体阳性率为11.11%（9/81）,RF阳性率为12.35%（10/81）,特异性均为91.35%;JIA组与正常对照组抗RA33抗体阳性率比较有统计学意义（P〈0.05）,与其他关节性疾病对照组比较差异无显著性（P〉0.05）。JIA组中抗RA33抗体的检出与RF无相关性（P〉0.05）;在JIA各亚型中抗RA33抗体主要存在于全身型和多关节型,各占33.3%和25.0%,RF则只出现于多关节型,占62.5%。两者比较有显著性差异（P〈0.05）。81例JIA患儿中共有18例关节出现影像学改变,其中4例抗RA33抗体阳性（22.2%）,与未发生影像学改变的JIA患儿比较无显著性差异（P〉0.05）。结论：抗RA33抗体尚不能作为JIA早期诊断的新的可靠性指标,抗RA33抗体主要见于全身型和多关节型,对JIA的分型有指导意义。     

发热伴血小板减少综合征病毒中和抗体酶联免疫吸附试验方法的建立及应用

本文旨在对发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)患者中和抗体进行定性和效价评估,建立中和抗体酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。用96孔微量培养板培养非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)并接种发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV),以抗核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)单克隆抗体为一抗,使用间接ELISA检测SFTSV NP,根据光密度(optical density,OD)判断阳性孔数,采用ReedMuench方法计算病毒半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID_(50)),以反映SFTSV在Vero-E6细胞中的复制水平。ELISA检测中和抗体作用后的病毒残余量,可间接反映中和抗体的作用效果并进行定量。应用以上建立的微量中和-ELISA对10例SFTS患者的双份血清进行中和抗体效价测定,8例患者恢复期血清效价较急性期增高4倍以上,7份患者恢复期血清效价达1∶1 280,急性期血清效价最高为1∶640。结果提示,本研究建立的ELISA操作简便,结果判定客观,所需时间短,可用于临床血清抗体诊断,也可用于血清流行病学调查和疫苗效果临床评价等。     

应用酶联免疫吸附试验检测不同类型乙型肝炎中激活补体类HBsAg循环免疫复合物

本文以抗人C_(?)的羊IgG为包被抗体,以HRP-HBs抗体为指示抗体,建立了可检测激活补体类HBsAg循环免疫复合物(HBsAg/C3-CIC)的C_3捕捉法酶联免疫吸附试验。检测了236例六种类型临床诊断为乙型肝炎的病人血清标本,其阳性率分别为:无症状携带者(ASC)12.9％(4/31),急性肝炎(AH)36.7％(22/60),慢性迁延性肝炎(CPH)33.3％(7/21),慢性活动性肝炎(CAH)59.6％(34/57),重型肝炎(SH)77.8％(14/18),肝炎后肝硬化(PLC)67.3％(33/49),阳性率与肝损严重程度明显相关(P<0.01)。认为HBs-Ag/C3-CIC可能在乙型肝炎病毒引起的慢性活动性肝炎、重型肝炎和肝炎后肝硬化的发病过程中起重要作用,并可作为乙型肝炎的诊断、临床分型和预后判断的指标之一。     

布鲁菌omp19原核表达和间接酶联免疫吸附试验检测布鲁菌方法的建立

本研究原核表达并纯化了布鲁菌脂蛋白Omp19,并通过蛋白免疫印迹法对其免疫原性进行验证。采用Omp19作为包被抗原,建立检测羊种布鲁菌的间接酶联免疫吸附试验(iELISA),检测90份羊血清样本,并与标准血清凝集试验(SAT)比较,用SPSS软件进行数据分析。结果显示,iELISA与SAT的阳性符合率为95.12%,阴性符合率为67.35%,Kappa值为0.607 7。对2种方法进行McNemar卡方检验,结果有显著性差异(P0.05)。本研究建立的iELISA与SAT的总符合率达80%,可作为羊种布鲁菌病血清学诊断的备用方法。     

金黄色葡萄球菌D型肠毒素抗血清制备和在肠毒素免疫检测上的应用

参考Robbins等文章,制定了制备抗-SED血清的免疫方案,抗原用量6.9mg/兔,注射8针,免疫时间共14周。用免疫双向琼脂扩散方法测定,抗-SED血清效价可达1:128,所制抗-SED血清与高纯度(98%)及低纯度(60%)的SED只产生一条沉淀线,并且融合,与SEA、SEB、SEC_1、SEC_2均没有交叉反应。以抗-SED抗体IgG制备的诊断血球检出灵敏度较高,约1ng/ml。对6种罐头食品人工污染毒素的模拟实验结果,检出灵敏度为1.56ng/ml,略低于含纯SED标本,食物成份对反向血凝检出没     

样品预处理对HCV-cAg酶联免疫吸附试验特异性的影响

目的:探讨血液样品预处理后对控制酶联免疫吸附试验中假阳性的效果.方法:向稀释血清样品中加入适量的C2H6OS和IgM抗体后,以HCV-cAg酶联免疫方法检测60份血清样品中丙型肝炎病毒核心抗原的阳性情况;与常规样品处理方法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测结果为标准进行比较分析.结果:60份血清样品,采用常规的样品处理方法检测出的阳性例数为34例,假阳性率迭25%;采用改良法检测出的阳性例数为23例,假阳性率达6.7%,二者相比差别具有统计学意义(P(≦) 0.05).结论:改良法血清样品预处理可提高ELISA法检出丙型肝炎病的特异性.     

基于TbpA蛋白的副猪嗜血杆菌抗体间接酶联免疫吸附试验检测方法的建立及应用

[背景]副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是猪革拉瑟氏病(Glasser's Disease)的病原体,抗生素治疗和疫苗接种对于防控该病效果不明显,建立快速、准确的抗体检测方法尤为重要.[目的]利用表达纯化的HPS转铁结合蛋白A(TbpA)建立检测HPS抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA...     

梅毒螺旋体TpN17与TpN47表位肽融合抗原的重组表达及其酶联免疫吸附试验的建立和应用

以重组TpNs为抗原的ELISAs已被证明是具有较高敏感性和特异性的梅毒血清学检测方法,若ELISAs使用多种TpNs抗原,可进一步提高检测敏感性和特异性.根据抗原表位分析结果,本研究首先采用连接引物PCR获得了TpN17和TpN47抗原表位序列融合成的人工基因片段tpE17-47,然后构建了全长tpN17,tpN47基因以及tpE17-47融合基因的原核表达系统.SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检查结果显示,所构建的原核表达系统能稳定表达目的重组蛋白rTpN17,rTpN47和rTpE17-47,其产量分别约占细菌总蛋白的36%、20%和28%.采用Ni-NTA亲和层析法提纯的rTpN17、rTpN47和rTpE17-47蛋白经SDS-PAGE分析,均显示为单一的蛋白条带.Western blotting结果表明,rTpN17、rTpN47和rTpE17-47蛋白均可被梅毒抗体阳性的病人血清所识别.以rTpE17-47为包被抗原的rTpE17-47-ELISA检测630例临床确诊梅毒患者血清标本的阳性率为98.6%,仅略高于TPPA(97.9%)(P>0.05),但明显高于rTpN17-ELISA(83.8%)、rTpN47-ELISA(83.3%)和RPR(72.1%)(P<0.01).上述ELISAs和TPPA对25例SLE、36例RA患者和250例健康体检者的血清标本检测结果均为阴性,但RPR分别有1、2和2例标本检测结果为阳性.本试验成功地构建了rTpE17-47抗原表位融合基因及其高效原核表达系统,所建立的rTpE17-47-ELISA可作为一种快速、简便、安全、敏感和特异的梅毒血清学筛查或诊断新方法.     

梅毒螺旋体TpN17与TpN47表位肽融合抗原的重组表达及其酶联免疫吸附试验建立和应用

以重组TpNs为抗原的ELISAs已被证明是具有较高敏感性和特异性的梅毒血清学检测方法,若ELISAs使用多种TpNs抗原,可进一步提高检测敏感性和特异性。根据抗原表位分析结果,本研究首先采用连接引物PCR获得了TpN17和TpN47抗原表位序列融合成的人工基因片段tpE17-47,然后构建了全长tpN17、tpN47基因以及tpE17-47融合基因的原核表达系统。SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检查结果显示,所构建的原核表达系统能稳定表达目的重组蛋白rTpN17、rTpN47和rTpE17-47,其产量分别约占细菌总蛋白的36%、20%和28%。采用Ni-NTA亲和层析法提纯的rTpN17、rTpN47和rTpE17-47蛋白经SDS-PAGE分析,均显示为单一的蛋白条带。Western blotting结果表明,rTpN17、rTpN47和rTpE17-47蛋白均可被梅毒抗体阳性的病人血清所识别。以rTpE17-47为包被抗原的rTpE17-47-ELISA检测630例临床确诊梅毒患者血清标本的阳性率为98.6%,仅略高于TPPA(97.9%)(P>0.05),但明显高于rTpN17-ELI...     

靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂酶联免疫吸附法高通量筛选模型的优化与应用

在经典的Wnt/β-catenin信号通路中,β-catenin/TCF4 (T-cell factor 4)相互作用在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)的生长分化、化疗耐药、转移复发等过程中发挥着重要的促进作用,已成为新型靶向性抗NSCLC转移药物开发的理想靶标之一.为了...