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1.
端粒酶RNA的反义cDNA对乳腺癌细胞端区长度的影响 总被引:11,自引:3,他引:8
应用反义核酸技术,将端粒酶RNA的cDNA反向插入整合型腺病毒载体pAdE1CMVITREXneo,与pB-HG11X共转染293细胞反获得反义重组病毒。将此反义重组病毒感染乳腺癌细胞MCF-7后,使细胞端区长度缩短。 相似文献
2.
重组腺病毒介导的白细胞介素—12(IL—12)在肝癌细胞中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
利用腺病毒表达系统在肝癌细胞中成功地表达了有生物活性的白细胞介素-12(IL-12)。IL-12的P35和P40 cDNA分别克隆到腺病毒载体pACCMV.pLpA,构建pAC/P35和pAC/P40表面质粒。与腺病毒重组质粒pJM17共转染293细胞,通过基因重组产生IL-12P35和P40重组腺病毒。用重组腺病毒感染肝癌细胞株HepG2和SMMC7721,经ELISA和Western检测证明, 相似文献
3.
表达流行性感冒病毒血凝素蛋白的重组腺病毒的构建 总被引:5,自引:0,他引:5
用RT-PCR方法扩增流感病毒血凝素基因,将其克隆到5型腺病毒载体质粒pAD5C中。用此质粒与EcoRI酶切回收的5型腺病毒基因组片段共转染293细胞,通过PCR初步筛选得到重组病毒。SDS-PAGE电泳、West-ern blot重组病毒能表达流感病毒的血凝素蛋白。此重组病毒经滴鼻免疫Balb/C小鼠,ELISA实验证明能诱导小鼠产生针对流感的循环抗体IgG和分泌型抗体IgA。本实验证明,利用E 相似文献
4.
人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
从诱导的人胚肺细胞HFL株中提取总RNA.经RT-PCR反应获取了人GM-CSFcDNA,DNA序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用PCR改造了人GM-CSF的cDNA5’端核苷酸序列,并将改造的人GM-CSF基因插入含T7启动子的质粒pET-11d构建成表达质粒pETC-5,将此质粒转化大肠杆菌株BL21(DE3)得到表达菌株BLEC4。表达菌株用0.5mol/LIPTG诱导2小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。SDS—PAGE电泳图谱扫描结果表明,rhGM-CSF产量占菌体总蛋白量的16%。ELISA和TF-1细胞培养测定表明,初步纯化和复性的rhGM-CSF具有天然的hGM-CSF生物活性。 相似文献
5.
将含脊髓灰质炎病毒(PV)RNA聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体pSG5质粒上,分别构建了4个表达RNA聚合酶的质粒。体外转录实验证明,pSG5-POL1.99和pSG5-POL2.03质粒转染细胞的提取物促进了特异的RNA转录,表明两质闰可表达RNA聚合酶。将PV的5’NCR序列插在载体pGREEN LANTERN-1的CMV启动子下游,构建了pGREEN LANTERN-1-5’NCR质粒; 相似文献
6.
腺病毒介导的bak基因诱发肿瘤细胞的凋亡 总被引:1,自引:0,他引:1
构建了含bak基因的转移载体pCA13-bak,并用该载体和含有Ad-5(人腺病毒5型)大部分基因组的重组质凿pBHG11共转染293细胞(转化人胚肾细胞系),分离并提纯缺陷型病毒Ad-bak。用该病毒感染HeLa细胞(人宫颈癌细胞系),相差显微镜、扫描电子显微镜直接观察到了典型的细胞凋亡形态,联蛋埃Annexin)V-FIOT7凋亡试剂盒检测到原本位于细胞3膜内侧的磷脂酰丝氨酸向外播转,进一步证 相似文献
7.
人脑源性神经营养因子cDNA在COS7细胞中的表达及活性研究 总被引:4,自引:0,他引:4
本文从质粒M13mp18-hBDNF中酶切回收人脑源性神经营养因子(hBDNF)全长基因,构建真核表达载体pCMV4-hBDNF。利用脂质体的方法转染COS7细胞,对转染后的COS7细胞提取RNA进行狭缝杂交分析和免疫细胞化学反应,分别从转录及翻译水平上检测BDNF基因在COS7细胞中的表达。实验还证实在COS7细胞中表达的hBDNF蛋白可分泌至胞外并可促进中脑黑质细胞的发育和生长,具有良好的生物学活性。 相似文献
8.
人脑源性神经营养因子cDNA在COS7细胞中的表达及活性… 总被引:1,自引:0,他引:1
本文从质粒M13mp18-hBDNF中酶切回收入及源性神经营养因子(hBDNF)全长基因,构建真核表达载体pCMV4-hBDNF。利用脂质体的方法转染COS7细胞,对转染后的COS7细胞提取RNA进行狭缝杂交分析和免疫细胞化学反应,分别从转录及翻译水平上检测BDNF基因在COS7细胞中的表达。实验还证实在COS7细胞中表达的hBDF蛋白可分泌至胞外并可促进中脑黑质细胞的发育和生长,具有良好的生物学 相似文献
9.
利用脑炎心肌炎病毒的内核糖体进入位点连接人TNF-αcDNA和选择基因NeoR基因,使TNF-α及NeoR基因均受控于病毒LTR启动子,将两基因同时转录至同一mRNA,从而构建成人TNF-α双顺反子逆转录病毒载体pGCEN/TNF-α.在LipofectAMINE介导下将其导入包装细胞PA317,G418筛选得单克隆,病毒滴度为106CFU/ml重组病毒分泌的细胞株.经PCR证明外源基因已整合至细胞基因组,Northern印迹显示出单一LRT转录本.持续G418筛选能明显促进目的基因TNF-α的表达.用重组病毒上清感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,G418筛选获得的混合抗性克隆持续高表达TNF-α,40Gyγ线照射后能维持高效表达至7d.实验结果表明,含IRES的双顺反子逆转录病毒载体将是一个很好的基因转移载体. 相似文献
10.
将抗癌胚抗原(CEA)单链抗体基因插入家蚕杆状病毒转移载体pBacPAKHis, 与修饰的家蚕核型多角体病毒BmBacPAKDNA共转染家蚕细胞, 经同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的抗CEAScFv 基因的重组病毒BmBacScFv。用重组病毒分别感染家蚕细胞和幼虫, 在两者中均得到了高效表达, 产物分子量为28kD, 前者占细胞总蛋白的6 % , 后者为0 .3 mg/ 蚕。目的基因在家蚕细胞和幼虫中表达产物经Ni2+IDASepharose6B亲和柱纯化, 前者纯度可达90% 以上, 后者纯度较低; 纯化后的融合蛋白具有CEA 结合活力, 其亲和常数分别为5 .4×108/mol·L- 1 和2.3 ×108/mol·L-1 , 略低于其亲本单抗E7B10 2.7 ×109/mol·L- 1 。 相似文献
11.
腺病毒载体具有在离体细胞和动物体内高效转移和表达外源基因的优点,但由于第一代腺病毒载体能在靶细胞内表达病毒结构蛋白,并诱导机体的细胞和体液免疫反应,影响了目的基因在体内的稳定表达。为了克服这一缺点,构建了一种辅助病毒依赖型腺病毒载体HAdI-hFVII。该载体去除了病毒基因组的l3、L1、L2、VAI-VAI、pTP等基因序列。在第一代重组病毒AdI-hFVII辅助下,能在293细胞包装和扩增。经氯化铯梯度超速离心后,能与辅助病毒有效分离。小鼠体内研究表明,该载体能在体内高效转移和表达hFVII基因。与笫一代腺病毒载体比较,外源基因表达稳定性明显提高,提示该载体在体内具有较低的免疫原性。 相似文献
12.
一种辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建及其在小鼠体内 … 总被引:1,自引:0,他引:1
腺病毒载体具有在离体细胞和动物体内高效转移和表达外源基因的优点,但由于第一代腺病毒载体能在靶细胞内表达病毒结构蛋白,并诱导机体的细胞和体液免疫反应,影响了大体内的稳定表达。为了克服这一缺点,构建了一种辅助病毒依赖型腺病毒载体HAdI-hFVIII。该载体去除了病毒基因组的l3、L1、L2、VAIVAII、pTP等基因序列。在第一代重组病毒AdI-hFVIII辅助下,能在293细胞包装和扩增。经氯化 相似文献
13.
用PCR法扩增出编码人FAS分子胞外区的cDNA片段,直接克隆到pGEM-T载体上,经DNA序列测定后,再插入到谷胱甘肽转硫酶(GST)融合蛋白表达载体pGEX-KG的EcoRⅠ和SalⅠ位点之间,构成重组质粒pKG-hFAS,将此质粒导入大肠杆菌,经IPTG诱导后获得GST-hFAS重组融合蛋白的表达,用谷胱甘肽偶联的Sepharose4B经亲合层析获得纯化的GST-hFAS蛋白,经凝血酶酶切和二次亲合层析去除GST部分,得到纯化的FAS蛋白.用纯化的FAS抗原免疫家兔制备了抗FAS抗体,经检测发现抗FAS抗体能诱导U937细胞发生细胞凋亡 相似文献
14.
将含有鸡传染性支气管炎病毒 S1 基因c D N A 的重组转移质粒p S X I V V I+ X3 S1 . Holte 和p S X I V V I+ X3/4 S1 . Holte 分别与粉纹夜蛾核型多角体病毒 Tn N P V S V I- G D N A( O C C- ,gal+ ) 共转染草地夜蛾( Sf9) 细胞,经空斑纯化得到重组病毒 Tn N P V( X3) S1 . Holte O C C+ 和 Tn N P V( X3/4) S1 . Holte O C C+ 。将重组毒株分别感染 Tn5 B1 细胞,并进行 S D S P A G E 与 Westernblot 检测。结果表明, Tn N P V( X3/4) S1 . Holte O C C+ 在感染的细胞中高效表达了 S1 蛋白, S D S P A G E 凝胶薄层色谱分析结果显示,感染病毒后72 h S1 蛋白的表达量占细胞内总蛋白量的35 .8 % ,而 Tn N P V( X3) S1 . Holte O C C+ 感染的细胞内检测不出 S1 蛋白。经分析认为这一差异主要来自 S1 基因翻译起始位点及其附近的周围环境。 相似文献
15.
利用COS7细胞暂时表达系统,研究转译起始序列对EPO-cDNA表达的影响。通过DNA重组技术,构建了原EPO-cDNA表达载体pCSV-EPO(1),其转译起始序列为5'AATTCATGG3'。同时通过定点突变技术,将起始序列改变成5'CCACCATGG3',而构建了另一表达载体PCSV-EPO(2)。后经序列分析证明无误后和前均通过DEAE-dextran法转染COS7细胞上清,测定结果为 相似文献
16.
GDNF重组腺病毒的构建及促进多巴胺能神经元存活的研究 总被引:4,自引:0,他引:4
利用体内同源重组原理,构建了能介导GDNF基因转移和表达的复制缺陷型重组腺病毒AdCMVgdnf,其中GDNFcDNA插入腺病毒基因组的E1区并由CMV启动子控制在人293细胞内通过同源重组包装生成重组腺病毒后,用形态学方法、病毒DNA酶切分析、PCR和RT-PCR等方法进行鉴定正确.经测定病毒滴度达到1010pfu/ml.用免疫沉淀方法从重组腺病毒感染的293细胞及其培养基上清中均检测到大量GDNF蛋白.用重组腺病毒直接感染或者用其条件培养基处理,分别使胚胎大鼠中脑原代多巴胺能神经元的数目增加88.2%和96.4%,明显增加多巴胺能神经元存活,对帕金森氏病基因治疗具有重要意义 相似文献
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Egr-1基因调控序列连接OSM cDNA表达质粒的构建及其在黑色素瘤细胞中的表达 总被引:6,自引:0,他引:6
OSM是一种对黑色素瘤细胞显示抑制作用的细胞因子.为进行OSM针对黑色素瘤的基因-放射治疗研究,构建了小鼠Egr-1基因调控序列引导入OSMcDNA真核表达质粒(pEO),pEO质粒转染小鼠B-16黑色素瘤细胞,经G418和抗人OSM抗体的筛选,获得了稳定表达OSM的克隆细胞(pEO-1细胞),OSM表达量可达5.97ng每105细胞天,分子量为32kD.pEO-1细胞用一定浓度H2O2处理后OSM表达量可提高62%,表明pEO重组质粒可在氧自由基的刺激作用下增强OSM表达 相似文献
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表达新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的重组鸡痘病毒及其免?… 总被引:11,自引:0,他引:11
将将城疫病毒(NDV)F48E8株融合蛋白基因导入鸡痘病毒(FPV)插入载体pEGF1175-1的P7.5启动子下游,得到转移载体pFG1175-1重组质粒。采用脂质体转染技术,将该质粒转染FPV282E株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)。,经过多次蓝斑筛选纯化,获稳定的重组病毒rFPV-NDF。间接免疫荧光试验表明,rFPV-NDF感染的CEF中表达了NDV的融合蛋白。用rFPV-NDF免疫的SF 相似文献
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汉滩病毒A9株M基因片段在重组痘苗病毒中的表达及鉴定 总被引:7,自引:0,他引:7
为发展国产化肾综合征出血热(HFRS)病毒基因工程疫苗,选择了汉滩病毒A9株M基因片段为目的基因,构建转染质粒pJSBA9M。以携带Lac基因的重组病毒为亲本,使表达载体pJSB-A9M上的M片段与痘苗病毒内的Lac基因重组,将Lac置换成A9M片段。用蓝白斑法筛选重组痘苗病毒,经PCR扩增证实A9M片段重组入痘苗病毒基因组内。重组痘苗病毒感染的Vero E6细胞,用抗糖蛋白单克隆抗体(HCO2、 相似文献