过表达VHA-c4和VHA-c5基因对拟南芥根长的影响

为研究液泡H+-ATPase c亚基VHA-c4和VHA-c5基因在植物生长发育过程中的作用,本研究构建了拟南芥VHA-c4和VHA-c5过表达载体并转化野生型拟南芥,分别获得9个和7个T2代转基因纯合体株系。采用半定量RT-PCR方法对过表达VHA-c4和VHA-c5的转基因纯合体进行阳性鉴定,发现其mRNA表达量均高于对照。对转基因纯合体进行暗培养和正常光照培养,结果显示,黑暗条件下,所有VHA-c4转基因株系的主根变短,而在正常光照下,所有VHA-c5转基因株系的主根变短,推测VHA-c4和VHA-c5分别在黑暗和光照条件下影响植物根的生长。用ABA和糖(葡萄糖和蔗糖)处理转基因纯合体,结果显示它们与野生型的表型无明显差异,表明VHA-c4和VHA-c5基因的过表达没有影响拟南芥对ABA和糖的响应。     

过表达VHA-c3基因拟南芥对黑暗、ABA与糖的响应

为研究液泡H+-ATPase c亚基基因(VHA-c3)在植物生长发育及非生物胁迫应答过程中的作用,构建了VHA-c3过表达载体转化拟南芥,获得过表达VHA-c3的转基因纯合体植株,采用半定量RT-PCR技术分析了转基因拟南芥中VHA-c3的表达量,然后对转基因拟南芥进行暗培养、ABA和糖处理。结果获得6个T2代株系转基因纯合体株系,其m RNA表达量均高于对照;黑暗条件下,5个VHA-c3转基因株系的根长变短;在正常光照下,3个转基因株系主根伸长和子叶的展开以及5个转基因株系的种子萌发对ABA的抑制不敏感;分别有5个和6个转基因株系的种子萌发对葡萄糖和蔗糖的抑制不敏感。推测VHA-c3可能影响根细胞的扩展,并可能参与ABA和糖介导的信号转导途径。     

毛木耳白色突变体的遗传规律及分子标记开发

2016年秋季,漳州一农户种植的褐色毛木耳Auricularia cornea品种“43012H”发生白色突变,有的菌袋同时长出褐色、白色、褐色与白色交杂的颜色嵌合体耳片,有的菌袋长出白色耳片,而有的菌袋出菇颜色正常。采集白色耳片、褐色耳片和嵌合体耳片进行组织分离,得到的菌种进行栽培试验,从褐色耳片（正常）分离获得的菌种（AC_B）,种植得到正常的毛木耳子实体;从白色耳片（突变）分离获得的菌种（AC_W）,种植得到纯白色子实体;从颜色嵌合体耳片分离获得的菌种（AC_R）,栽培后也只长白色子实体,没有出现嵌合体子实体。AC_B分别与AC_W、AC_R的菌种混合接种栽培,菌袋中同时长出白色、褐色和嵌合体耳片。再次进行组织分离与栽培试验,性状稳定。对AC_B和AC_W进行基因组测序,获得2个与本研究中所用菌株的耳片颜色相关的SNP位点,即SNP1和SNP2。上述组织分离得到的菌株中,褐色菌株的基因型为SNP1 A/G（杂合）、SNP2 A（纯合）,白色菌株的基因型为SNP1 G（纯合）、SNP2 A/C（杂合）。     

水稻叶绿素a氧化酶基因突变体的鉴定及其对氮营养的响应

对从日本获得的水稻Tos17插入突变基因进行了鉴定,并通过PCR技术对其插入位点和纯合体进行了分析和筛选。结果表明,Tos17插入在序列号为DP000086的基因,在此基因反向互补序列的1579bp处,在mRNA序列的第5个外显子区域,是水稻的一个叶绿素a氧化酶基因,而且此基因在单一的铵营养下表达减弱,氮饥饿条件下表达增强。利用Tos17未端和插入位点上下游设计引物进行PCR反应,鉴定到3株纯合突变体株,为进一步研究其功能奠定了基础。     

低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型的构建

目的：构建低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型。方法将 Cchl1a3-knock-in打靶载体电转染ES细胞,经过G418和Ganciclovoir筛选阳性ES细胞克隆并用PCR和DNA测序法鉴定。将阳性ES克隆注射到小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠。通过杂交获得的杂合子小鼠与FLP小鼠交配繁育获得去neo杂合子小鼠,并用PCR和DNA测序进行鉴定。将去neo杂合子小鼠交配得到纯合子后代,进行生长发育等方面的观察。结果打靶载体成功转染ES细胞,PCR和DNA测序法证实9个ES细胞克隆发生正确的同源重组。通过显微注射获得7只嵌合体小鼠。将嵌合体小鼠交配繁育的杂合子小鼠和FLP小鼠交配获得9只去neo杂合子小鼠,最终得到15只去neo纯合子小鼠。该小鼠在发育至性成熟阶段,精神、饮食及活动状态良好,但是在4个月龄时逐渐出现脱毛,皮肤破溃甚至死亡。结论成功构建Cchl1a3基因 R528H 突变的纯合子小鼠,为研究人类CACNA1S基因功能和阐明低钾型周期性麻痹发生的分子机制奠定了基础。     

转基因水稻U41三引物检测方法的建立

对于研究转基因农作物来说,建立其检测方法至关重要。本研究利用TAIL-PCR法,获得了转基因水稻U41的右旁侧序列,结果显示T-DNA插入位点在水稻1号染色体第22013～22014之间。通过设计引物扩增左旁侧序列,建立了U41转化事件特异性检测的方法,可以从含0.1%目的基因中扩增出529bp的特异性条带;还建立了三引物检测的方法,能快速和准确地鉴定U41的纯合株系。这些方法的建立,缩短了获得U41纯合体的时间,对U41的检测、研究和利用具有实用价值。     

表达γ-亚麻酸的无筛选标记转基因大豆的鉴定

对所获得的9株无筛选标记基因的T1代莆豆8008转基因大豆的T2代进行了分析。PCR和Southern杂交检测表明标记基因已不存在于转基因株系中,同时目的基因以纯合或者杂合状态存在于部分株系中,除草剂抗性分析也表明这些转基因株系已不再具有抗除草剂的能力。Northern杂交检测表明Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因株系中可以转录。GC分析表明其中6个转基因植株富含GLA。     

小麦M_1代长芒突变嵌合体的遗传研究

在辐射诱变的实践中通常认为:M_1代所有的新的突变都将是杂合体,本文报道了用r-射线诱发长芒突变嵌合体的试验结果,并对嵌合体进行了遗传分析,结果表明:M_1代嵌合体的长芒突变是一种隐性基因突变,它可以是纯合突变。因此,M_1代是一个值得注意的突变世代。     

四倍体补偿技术的建立及其应用

常规基因剔除小鼠的获得主要是利用ES细胞的全能性先获得嵌合体小鼠,再利用:ES细胞的生殖系传递能力,通过嵌合体与野生型小鼠的交配获得杂合子小鼠.而四倍体补偿技术则可绕过嵌合体小鼠阶段,直接获得基因修饰杂合子小鼠.利用电融合技术和Piezoelectric microinjecfion显微注射技术建立了四倍体补偿技术,小鼠四倍体胚胎的获得率(电融合率)为(93.01±l.37)%,经体外培养囊胚形成率为(82.49±2.08)%.通过显微注射方法将2种129品系小鼠来源的ES细胞(CJ7和SCR012)注射到四倍体囊胚腔中,获得了完全ES细胞来源的小鼠,ES鼠的获得率分别为2.7%和8.3%.经微卫星DNA检测,成体小鼠的10个被检测组织均为129小鼠来源的.同时,也利用基因修饰的ES细胞进行了研究,获得了2种基因修饰的完全ES细胞来源的杂合子小鼠,部分小鼠具有繁殖能力,经繁育已获得了纯合子,其中凝血因子Ⅷ基因敲除小鼠获得了预期的血友病小鼠表型.上述结果说明四倍体补偿技术可应用于基因修饰小鼠的制备.     

一种快速鉴定转基因植物纯合体的新方法

植物转化中鉴定转基因植物的整合性是一个很重要的步骤,常规方法是对独立分离的转基因T1代植株产生的T2代进行转基因分离比率研究,以检测T1代的转基因整合状态,不仅费时费力,而且浪费了T1代资源。本介绍一种应用双重定量实时PCR技术鉴定转基因植物纯合子的新方法：以T1代植物DNA为模板,根据转基因后代的Ct表型值鉴定其转基因整合状态,Ct值接近2的为转基因纯合型,Ct值接近1的为转基因杂合型。用这种方法,可以同时对数十个T1代转基因幼苗的整合状态进行快速鉴定,准确率为100％。