转基因动物及其在医学研究中的应用

转基因动物(transgenic animal)是指基因组中稳定地整合有以实验方法导入的外源DNA的动物。被导入的外源基因称为转基因(transgene)。1974年美国学者Jeanisch等首次应用显微注射的方法将SV40 DNA注射到小鼠囊胚腔内,在子代小鼠的许多组织中含有该DNA,后来研究证明该DNA以非整合的附加体     

应用荧光原位杂交技术检测人β^E珠蛋白基因小鼠染色体上的整合状态

为将荧光原位杂交技术应用于基因定位研究中,探讨一种能有效地检测转基因动物染色体上外源基因整合状态的实验方法,对小鼠腹腔注射秋水仙素后,取转基因小鼠骨髓制备中期染色体,将传统的FISH方法加以改进,检测外源基因在转基因小鼠染色体上的整合状态。检测结果表明,外源人β^E珠蛋白基因已稳定地整合于小鼠染色体上,FISH能直观地反映外源基因在转基因动物染色体上的整合状态,该方法可对转基因动物及基因转移研究中的外源基因整合反进行染色体定位检测。     

外源基因在一个转基因水稻四倍体变异株系中的遗传行为

在基因枪介导转化的转基因水稻植株中发现1个四倍体变异株系XIP-4N．该变异株系T₀代植株中转基因的整合模式与二倍体转基因株系XIP-2N相同,并且二者来自同一转化体系,推测XIP-4N株系是转化后的水稻愈伤组织在细胞有丝分裂过程中发生染色体加倍产生的．对外源筛选标记基因bar和非筛选基因cecropinB在转基因株系XIP-4N和XIP-2N中的遗传行为进行了比较研究．在二倍体转基因株系XIP-2N中,bar和cecropinB基因的Southern整合模式从T₀到T₂代遗传稳定,单位点整合的bar基因按孟德尔单基因显性方式向后代传递．四倍体转基因株系XIP-4N中外源基因遗传行为复杂,单位点整合的bar基因（Basta抗性）T₁代按15∶1分离,T₂和T₃代中分离行为复杂,而且bar和cecropinB基因的整合模式遗传不稳定．同源四倍体水稻植株减数分裂过程中染色体结构变异、转基因相关位点DNA片段的遗传重组与修饰,以及由此导致配子的育性降低,可能是导致外源基因遗传行为复杂的主要原因．转基因四倍体水稻变异株系XIP-4N携带易于检测的bar基因,为研究同源四倍体水稻的遗传和生殖机理提供了好材料．     

转Xa21基因水稻中T-DNA整合的遗传定位

利用转抗白叶枯病基因Xa21的水稻材料,通过TAIL－PCR方法扩增T－DNA整合的侧翼序列。从中筛选属于水稻基因组DNA的T－DNA整合的侧翼序列作为探针,将外源基因整合位点定位到窄叶青／京系17DH群体构建的水稻分子连锁图谱上。共获得属于水稻基因组DNA的T－DNA侧翼序列22个,其中的19个序列在定位群体的两个亲本之间显示RFLP多态性,分别定位在水稻基因组的第3,4,5,7,9,10,11和12染色体上。带有转基因Xa21的T－DNA整合的定位为研究外源基因在不同染色体位点的位置效应和稳定遗传打下基础。     

应用微量注射技术转化植物细胞

<正> 应用微量注射使一部分染色体转入矮牵牛的细胞中。此间,一位农业生物学者报道了用此技术把 DNA 片段形式的基因组稳定地整合到植物体中的情况。由于这种基因组太大,采用病毒或质粒载体进行转移是难以进行的。1980年以来科学家们很成功地把基因注入到动物     

总DNA介导鱼类基因转移的初步研究

自七十年代我国开始将外源总DNA转移技术应用于棉花和水稻品种改良的研究中,但至今尚未见有关鱼类总DNA转移成功的报道。本实验采用显微注射和精于载体的方法将鲫鱼肝总DNA转移到红鲤受精卵,利用鯽鱼和红鲤在孵化前后色素表达的差异来筛选转移基因个体。此方法无需克隆目的基因及DNA重组操作,而且筛选简便,目的在于探讨总DNA转移方法应用于鱼类品种改良的可能性。     

基因打靶及其应用

用活细胞染色体DNA可与外源性DNA同源序列发生同源重组的性质,达到定点修饰改造染色体某基因的目的,此法称基因打靶．基因的同源重组是较普遍的生物现象,其分子机理尚未阐明,但活细胞内确有一酶系可使DNA的同源序列在细胞内发生重组,这一事实已无可争辨．此事实为基因打靶的理论基础．基因打靶技术操作的关键是建立一含筛选基因的重组载体,并有效地把它转入细胞核内．基因打靶命中的细胞可稳定遗传．基因打靶在改造生物品种,一些复杂生命现象（如发育的分子机制等）及临床理论研究均有广阔的前景．     

人乳铁蛋白(hLF)转基因山羊的遗传背景分析

以随机整合方式获得的转基因动物外源基因的拷贝数、整合位点及染色体核型等遗传背景并不清楚,可能会存在外源基因的沉默整合、无效整合、毒性整合以及其表达水平不可预测等问题。文中选取了6只原代(F0)及其相对应的子一代(F1)的人乳铁蛋白(hLF)转基因山羊作为研究对象,分别颈静脉采血、提取DNA,通过染色体核型分析、实时荧光定量PCR(qPCR)、ELISA和Westernblotting等检测技术,研究其外源基因的遗传背景与表达水平。结果显示,6只F0代转基因山羊的染色体没有明显的形态变异、数量改变等异常情况。相对拷贝数高低不同(2–16),且能够稳定地遗传给下一代,F0和F1代hLF基因拷贝数一致。F1代转基因山羊表达hLF水平最高可达1.12 g/L(L3-1,拷贝数8)。结果表明,整合的外源基因能够稳定地遗传下一代,也没有对转基因山羊个体的生长发育造成障碍,而且拷贝数高低与hLF表达水平无明显的相关性,这为转基因山羊及其他转基因动物的新品种培育奠定了基础,解析了遗传背景。     

HLA-Ⅱ类基因DRα及DRB1*0401转基因小鼠的制备

利用受精卵原核的显微注射技术,将人类HLA-Ⅱ类DRα及DRB1 *0401两种基因,显微注射至C57BL/6×DBA/1杂交小鼠受精卵中;并移植至假孕受体鼠的输卵管内.实验先后有8只鼠妊娠,稳定遗传五代,经PCR检测95只HLA-DRα、DRB1*0401阳性.α-32P-dCTP斑点杂交与Southem印迹杂交鉴定出68只整合含有DRα及DRB1 *0401混合型的转基因小鼠,有效率为20.9%.经Northern杂交…和RT-PCR检测,其HLA-DRα、DRB1 *0401基因在脾脏和肾脏中均有表达.结果说明,携带人类HLA-Ⅱ类DRα和DRB1* 0401基因的转基因动物模型构建成功.     

E.coli galk和gpt基因重组质粒(pIDB103)导入金鱼受精卵内的研究

用显微注射法把含有E.coli galk和gpt基因的环状和线状重组DNApIDB103分别导入金鱼受精卵的细胞质内。这些注射过的卵子一般都能正常发育。从各不同发育时期的胚胎分离DNA与~(32)P标记的pIDB103探针杂交表明,导入的环状外源重组DNA在胚胎发育的早期,绝大部分以各种环状构型存在。从原肠胚晚期开始,它们逐渐形成串联状高分子量DNA。在尾芽期仍能检测到它们的序列。但尚未证明,它们是否与受体的染色体DNA发生整合。我们从囊胚期的胚胎中回收到了能转化大肠杆菌的环状重组DNA,它的酶切图谱和pIDB103极其相似。导入金鱼受精卵内的线状重组质粒pIDB103,除少量DNA与金鱼的染色体DNA可能发生整合外,其余绝大部分也形成高分子量DNA。     

影响大肠杆菌中外源基因表达的因素

大肠杆菌已经被广泛地应用于表达各种外源基因,但是,不同的外源基因在表达效率上却有很大的差异,文章综述了影响大肠杆菌中外源基因表达的因素,这将有助于认识大肠杆菌中外源基因表达的规律,以便采取有效的方法提高外源基因在大肠杆菌中的表达效率．     

大叶落地生根类糖原合成激酶KdSK基因的克隆与表达分析

类糖原合成酶激酶(SKs)属于丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,在植物器官发育、激素信号传导过程中十分重要,并参与生物胁迫、非生物胁迫的应答过程。大叶落地生根中的胎生苗发育过程,同时具备胚胎发生和器官发生的特征,是研究无性生殖的理想模型。为了更好地理解大叶落地生根中胎生苗发育的分子机制,该研究利用RACE-PCR技术,从大叶落地生根中克隆了1个新的基因KdSK。该基因具有423个氨基酸残基,分子量为47.79 kD,等电点为8.37,其开放阅读框长为1 272 bp。其蛋白与黄瓜的同源性最高,属于植物类GSK3/shaggy蛋白激酶家族的第Ⅳ类,与苜蓿(MSK4)蛋白在进化关系上最近,且与拟南芥(AtSK4-1、AtKSK4-2)聚为一枝。保守域结构分析表明,KdSK蛋白具有明显的蛋白激酶的结构域,包括蛋白激酶的ATP结构域和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活化结构域。实时荧光定量PCR分析表明,该蛋白基因在大叶落地生根的根中表达量最高,且受渗透胁迫(甘露醇)的诱导上调表达。该研究首次从大叶落地生根中克隆出KdSK基因,该研究结果为进一步研究该基因的功能打下了基础。     

西南地区野生刺梨的遗传多样性和遗传结构研究

为了探究西南地区野生刺梨(Rosa roxburghii)的遗传多样性和起源演化,该研究基于2段单拷贝核基因(GAPDH和ncpGS)和3段叶绿体基因(atpF-trnH、trnL-trnF和trnG-trnS)的拼接序列,对刺梨27个野生居群共320个个体进行PCR扩增和测序,并用相关软件对测序结果进行分析。结果表明:(1)在单拷贝核基因和叶绿体基因水平上刺梨均表现出较低的遗传多样性(scnDNA: Hd=0.469 2, π=0.000 49; cpDNA: Hd=0.653 4, π=0.000 65),并且不同居群间存在较大差异。(2)分子方差分析(AMOVA)结果均显示,遗传变异主要发生在居群内,表明居群内的变异是野生刺梨遗传变异的主要来源,居群间存在明显的遗传分化( cpDNA:F_ST=0.336 47,G_ST=0.273,N_ST= 0.308; scnDNA:F_ST=0.094 87,N_ST=0.076,G_ST=0.056),刺梨的分布不具有明显的谱系地理结构(P>0.05)。(3)中性检验 Tajima''s D值均为不显著负值,符合中性进化模型。Fu''s Fs值均为显著负值,结合失配分析曲线,推测刺梨种群在小范围内经历过扩张,但总体上维持稳定状态。(4)根据单倍型多样性得出,毕节地区的居群遗传多样性水平较高并且拥有丰富的单倍型,推测可能为冰期避难所,因此应对其实施就地保护。对于拥有特殊性状和特有单倍型的居群也应采取优先保护措施。该文为野生刺梨资源保护和遗传育种提供了一定的参考价值。     

非编码的mRNA

非编码的mRNA是近年发现的一类不含典型ORF的mRNA.目前已发现或克隆的这类基因主要有：H19基因,XIST基因,XLSIRT基因,His-1基因,bic基因,rox1和rox2基因等.它们与胚胎发育,肿瘤发生及X染色体失活密切相关.     

毛竹APX基因系统进化与表达分析

抗坏血酸过氧化物酶(aseorbate peroxidase, APX)是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一,尤其是叶绿体中清除H₂O₂的关键酶,也是维生素C代谢的主要酶类。该文基于生物信息学方法,利用毛竹的基因组及转录组数据鉴定毛竹中的APX基因家族成员,并对其编码的蛋白基本理化性质、基因结构、启动子元件、系统进化及共线性关系、重复串联基因、GO注释及表达模式进行综合分析,共鉴定出21种编码APX的基因。结果表明:(1)PeAPX基因家族成员多为不稳定疏水蛋白,基因结构、基序及结构域相对较为保守,大多数APX基因具有高度保守的内含子模式。(2)系统进化关系显示毛竹APX基因与水稻APX基因有着较高的同源性关系,PeAPX具有较高的进化保守性。(3)Ka/Ks分析表明PeAPX基因都经历了纯化选择压力,此外在每个APX基因的启动子序列中发现有许多与应激反应和植物激素相关的顺式作用元件,结合表达量分析,表明毛竹APX基因在毛竹生长发育中起着正向促进作用。该研究为进一步了解毛竹APX基因家族基本功能及其抗氧化机制提供了一定的参考,为毛竹APX基因功能的深层次鉴定提供了重要依据。     

一种利用Cre/loxP系统进行标记基因删除与靶基因置换的细胞模型研究

Cre/lox系统可以介导DNA的定点插入和定点删除,可利用其实现转基因动物中"友好位点"的重复利用及标记基因的有效删除.为直观地评估该系统介导的以上两种重组反应的效果,通过标记基因并利用大鼠乳腺癌细胞系SHZ-88进行了模型研究.首先构建了两个载体:a.整合载体pTE-lox2272-DsRed-loxP-GFP-loxP,含有红色荧光标记基因DsRed和绿色荧光标记基因GFP;b.置换载体pT-lox2272-neo-loxP,含有筛选标记基因neo,用以置换DsRed基因.然后,用整合载体转染SHZ-88细胞,并随机挑取了3个同时表达DsRed和GFP的稳定整合细胞克隆.随后用置换载体和Cre表达载体PBS185对以上每个克隆分别进行了3次共转染,通过G418筛选并扩增培养后,总共获得1 070个克隆.通过分析标记基因DsRed和GFP在这些克隆中的表达情况:Cre介导的删除效率为91.1%,定点置换效率为29.3%.最后对部分克隆进行了PCR和DNA印迹鉴定,分子鉴定结果与发光的表型状况一致.这一方法为Cre/lox系统在转基因家畜生产中的进一步应用提供了实验依据.     

lats基因在细胞周期和肿瘤发生中的作用

lats基因(large tumor suppressor gene)最早在果蝇中发现,在小鼠和人中均有同源基因.该基因的功能从果蝇到人是高度保守的.lats基因的功能包括:作为肿瘤抑制基因,其突变会导致肿瘤的发生;磷酸化的Lats与Cdc2结合,参与细胞周期的调控;通过细胞-细胞间的通讯,可能参与生物体个体大小的调控机制.从果蝇到人lats基因功能的研究,提供了以果蝇作为模式生物研究哺乳动物基因功能的方法.     

铁皮石斛SPL膜结合(STM)转录因子的全基因组鉴定及表达分析

SPL转录因子广泛参与植物生长发育、胁迫响应等过程。目前,没有关于铁皮石斛SPL膜结合(SPL with transmembrane motif)转录因子即STM转录因子的研究。为了探究STM转录因子在铁皮石斛生长发育及胁迫响应等方面的作用,该文在铁皮石斛全基因组水平鉴定出4个STM转录因子,并对DoSTM基因家族成员进行生物信息学分析,又利用逆转录PCR研究了DoSTM在不同组织部位及不同逆境处理下的表达情况。结果表明:(1)DoSTM1-4为亲水蛋白,均具有SBP保守结构域和一些激素响应位点。(2)4个DoSTM在根茎叶中均有表达,DoSTM2在叶中的相对表达量最低; DoSTM1/3/4的相对表达水平均无明显差异。(3)DoSTM1-4在低温、高温、干旱胁迫下的相对表达水平都有显著变化,DoSTM1/3/4的表达量降低最为明显,故推测DoSTM与植物体内激素响应、温度变化响应及抗旱性有关。这些结论为后续进一步开展铁皮石斛STM转录因子的研究提供了参考。     

滇水金凤花距发育相关基因ABP的克隆及表达分析

为探究滇水金凤(Impatiens uliginosa)ABP基因的结构和表达特征,该研究以滇水金凤为材料,采用RT-PCR 技术对滇水金凤ABP基因进行克隆,运用DNAMAN和MEGA对其所编码的蛋白序列进行同源性分析和系统进化分析,并利用qRT-PCR分析ABP基因的时空表达模式。结果表明:(1)滇水金凤ABP基因的cDNA 全长为627 bp,编码208 aa,命名为IuABP基因,其蛋白具有Cupin超家族蛋白的典型结构。(2)同源性分析表明滇水金凤ABP基因的氨基酸序列与喜马拉雅凤仙花(I. glandulifera)、月季(Rose chinensis)、木薯(Manihot esculenta)等物种的同源性均达71%; 系统进化分析表明IuABP与喜马拉雅凤仙花(Impatiens glandulifera)聚为一支,亲缘关系最近。(3)qRT-PCR分析表明IuABP基因在滇水金凤花距发育的3个时期及2个部位均有表达。随着花距的发育,IuABP基因在滇水金凤花距檐部的表达量呈先下降后上升的趋势,在盛花期时达最高,而在花距距部的表达量逐渐下降。以上结果为进一步研究滇水金凤ABP基因在花距发育中的功能及其表达调控机制提供了一定的理论参考。     

hpc2研究进展

生物个体的胚胎发育以及细胞的增殖、分化,都同时受到多种基因的严格调控,PcG基因家族就是一类重要的发育相关基因.而hPc2基因是人PcG基因家族中的一个重要成员,其编码的HPC2蛋白,不仅可以和HPH、BMI-1以及RING1等其他人类PcG蛋白结合形成HPC/HPH PcG复合体,以蛋白复合体的形式参与对homeotic基因的表达抑制,以维持机体的正常发育以及细胞的增殖和定向分化,还发现它能与其他多种蛋白质相结合,提示HPC2可能具有多种功能.因此,对hPc2的深入研究不仅有助于进一步阐明PcG基因家族的作用机理,扩展人们对基因表达调控的认识,还有助于发现PcG基因家族与其他信号转导通路的联系,更好地理解细胞信号网络系统.