腺病毒E1B 55KD癌蛋白与hDaxx的相互作用

为了探讨腺病毒 (adenovirus,Ad)E1B 5 5kD癌蛋白 (AdE1B 5 5kD)打破hDaxx和PML共定位细胞核的作用机制 ,本文利用体内外共免疫沉淀反应研究AdE1B 5 5kD与hDaxx的结合反应 ,并通过酵母双杂交体系测定两种蛋白质的相互作用及其作用的氨基酸残基序列。结果显示 :Ad2E1B 5 5kD通过C端 5 8个氨基酸 (aa)与hDaxx结合并发生相互作用。Ad12E1B 5 5kD与hDaxx结合需全序列aa及其构象。共免疫沉淀反应和Westernblot结果证实Ad2 / 5或Ad12E1B 5 5kD能在体内外与hDaxx直接结合     

腺病毒E1B 55kD癌蛋白与hDaxx的相互作用

为了探讨腺病毒(adenovirus,Ad)E1B 55kD癌蛋白(Ad E1B 55kD)打破hDaxx和PML共定 位细胞核的作用机制,本文利用体内外共免疫沉淀反应研究Ad E1B 55kD与hDaxx的结合反应 ,并通过酵母双杂交体系测定两种蛋白质的相互作用及其作用的氨基酸残基序列.结果显示 Ad2 E1B 55kD通过C端58个氨基酸(aa)与hDaxx结合并发生相互作用.Ad12 E1B 5 5kD与hDaxx结合需全序列aa及其构象.共免疫沉淀反应和Western blot结果证实Ad2/5或Ad1 2 E1B 55kD能在体内外与hDaxx直接结合.     

腺病毒E1B55ku癌蛋白打破hDaxx与PML在细胞核的共定位

利用间接免疫荧光试验,通过Confocal激光扫描生物荧光显微镜和图像软件分析腺病毒(adenovirus,Ad)E1B 55 ku癌蛋白(Ad E1B 55 ku)与人Daxx(human Daxx,hDaxx)在细胞核的定位关系,研究它对早幼粒细胞性白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein,PML)与hDaxx在细胞核定位关系的影响.实验结果表明,Ad E1B 55 ku与hDaxx共定位细胞核,并打破hDaxx与PML共定位于细胞核PML致癌结构域(PML oncogenic domams,PODs).     

人死亡结构域相关蛋白干扰载体的构建与鉴定

[目的]构建人死亡结构域相关蛋白(hDaxx)的干扰载体,为研究hDaxx在HPV致宫颈癌发生与发展过程中的作用提供实验基础。[方法]以hDaxx全基因序列为模板,设计hDaxx RNA干扰引物并扩增干扰片段,将其连接到pGPU6/GFP/Neo真核表达载体,构建pGPU6/GFP/Neo-SiDaxx干扰载体,转染至HeLa细胞,利用荧光显微镜观察转染效率以及通过RT-PCR、Western Blot检测siRNA对HeLa细胞中hDaxx表达的影响。[结果]在转染了pGPU6/GFP/Neo-Si Daxx载体的HeLa细胞中,其hDaxx mRNA和蛋白的表达水平与空载体对照组比较明显降低。[结论]成功构建了hDaxx的干扰载体pGPU6/GFP/Neo-Si Daxx,该干扰载体能抑制HeLa细胞中hDaxx mRNA基因和蛋白的表达。     

Pin1在皮肤组织中的表达以及可诱导转基因小鼠模型的建立

目的观察Pin1在皮肤中的表达情况,构建Pin1在皮肤中可诱导表达的转基因小鼠模型。方法将小鼠Pin1基因克隆到改造过的可与Myc标签蛋白融合的p TRE2载体中,并将线性化的DNA通过显微注射的方式构建TRE-Pin1小鼠。结果成功获得TRE-Pin1转基因首建鼠,该小鼠与上皮特异的K14-rt TA转基因小鼠配繁,获得Pin1在皮肤上皮特异性可诱导表达的双转基因鼠;通过将多西霉素(又名强力霉素,Doxycycline)加入饮水的方式诱导Pin1基因的表达,并通过Western blot,免疫组织化学等方式证明了Pin1蛋白在皮肤上皮中能特异性地过表达。我们还发现内源的Pin1在皮肤中主要表达于上皮细胞。结论成功构建了Pin1在皮肤中可诱导表达的转基因小鼠模型,为后续研究Pin1在皮肤中的功能奠定基础。     

Pin1和Cyclin D1在人类5种常见肿瘤中的表达及其意义

目的研究人类的肽基脯氨酰异构酶(Pin1)在人类几种重要的肿瘤(肺癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌和胃癌)中的表达及与细胞周期蛋白CyclinD1的关系,并探讨它们在肿瘤的发病机制、诊断和治疗中的意义。方法随机收集33例正常组织和171例癌组织(包括37例肺癌、35例前列腺癌、31例乳腺癌、36例宫颈癌和32例胃癌)。采取免疫组织化学Envision法显示Pin1和CyclinD1的表达。结果Pin1和CyclinD1在正常组织中不表达或者低表达,而在各种癌组织中有普遍性的高表达,在肺癌组织、前列腺癌组织、乳腺癌组织、胃癌组织和宫颈癌组织中,Pin1的表达率分别为48·7%、65·7%、48·4%、15·6%和69·4%,CyclinD1的表达率分别为56·8%、60·0%、54·8%、40·6%和58·3%。Pin1和CyclinD1在癌组织中的表达明显高于正常组织中的表达(P<0·05)。Pin1和CyclinD1蛋白在肺癌、前列腺癌、乳腺癌和宫颈癌中表达呈显著正相关(P<0·05)。而Pin1和CyclinD1蛋白在胃癌中的表达相关性不显著(P>0·05)。结论Pin1和CyclinD1在多种肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用,如肺癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌和胃癌,Pin1与细胞周期代谢或调控有关。Pin1在某些肿瘤(如肺癌、前列腺癌等)中可作为肿瘤标记的参考指标。     

hDaxx与细胞肿瘤抑制子p53在体内外的相互作用

与急性早幼粒细胞性白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein,PML)在体内相互作用共定位于细胞核PML致癌结构城(PML oncogenic domains,PODs)的人Daxx(human Daxx,hDaxx),能结合Fas死亡结构域诱导细胞凋亡.细胞肿瘤抑制子p53抑制细胞及病毒转录,提高细胞内Fas的表达并调节细胞凋亡.为了探索hDaxx与p53在诱导细胞凋亡中有无相互作用及其作用效果,利用酵母双杂交体系测定发现p53通过C端与hDaxx结合,共免疫沉淀反应及Western blot结果显示hDaxx与p53能在体内外直接结合.hDaxx与p53结合并发生相互作用可能对细胞周期有一定的调节作用.     

Pin1促进肿瘤发展相关机制的研究进展

脯氨酰顺反异构酶1(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1,Pin1)为细胞内主要起信号传导作用的小分子蛋白。Pin1在肿瘤中的异常表达和信号调控促进肿瘤的发展,包括诱导耐药、辅助致肿瘤性病毒感染、参与肿瘤的缺氧代谢和其它信号调控等。本文对于Pin1的促肿瘤发展特点进行简要总结。     

Pin1在动脉粥样硬化及血管平滑肌细胞衰老中的作用

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的衰老与动脉粥样硬化的发生和发展有密切关联,但研究者对其潜在机制所知甚少。肽基脯氨酰异构酶(peptidyl-proplyl isomerase,Pin1)在人类癌细胞中普遍过表达,参与调节细胞的生长与凋亡。然而,到目前为止, Pin1在VSMC衰老调节中的作用还是未知。该研究运用蛋白质印迹实验证实了在人体动脉粥样硬化的VSMC中Pin1蛋白水平下调(P0.05),同时, p53、p21、Gadd45a以及p65的表达水平增加(P0.05)。经β-半乳糖苷酶染色法证实,动脉粥样硬化的VSMC衰老增加。腺病毒介导的Pin1过表达下调p53、p21、Gadd45a以及p65的表达。研究结果表明, Pin1介导的VSMC衰老是多信号因子参与的反应,提示Pin1是VSMC衰老调节机制中的关键因子。同时,该研究可能提供了一个调控动脉粥样硬化病理过程的新靶点。     

肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1在阿尔茨海默病发生发展中的作用

Pin1是目前发现的人体内唯一识别蛋白质中p Ser/p Thr-Pro的顺反异构酶,与阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)的发生存在重要联系.Pin1调控AD相关分子的结构和功能,抑制神经纤维缠结、老年斑、脑血管淀粉样沉积等AD病理学特征,促进神经前体细胞分化成神经元,在一定程度上起到了阻止AD发生和发展的作用.同时,人体内Pin1功能紊乱可能是AD发生机制之一,尽管如此,Pin1能否成为预防和治疗AD的靶蛋白还有待临床验证.鉴于目前针对脑内单分子的AD药物疗效较差,联合Pin1与相关分子的"多靶点药物组合"可能是一种未来AD防治的研究策略.     

Interaction between the human cytomegalovirus UL82 gene product (pp71) and hDaxx regulates immediate-early gene expression and viral replication

The human cytomegalovirus UL82-encoded pp71 protein is required for efficient virus replication and immediate-early gene expression when cells are infected at a low multiplicity. Functions attributed to pp71 include the ability to enhance the infectivity of viral DNA, bind to and target hypophosphorylated Rb family member proteins for degradation, drive quiescent cells into the cell cycle, and bind to the cellular protein hDaxx. Using UL82 mutant viruses, we demonstrate that the LXCXD motif within pp71 is not necessary for efficient virus replication in fibroblasts, suggesting that pp71's ability to degrade hypophosphorylated Rb family members and induce quiescent cells into the cell cycle is not responsible for the growth defect associated with a UL82 deletion mutant. However, UL82 mutants that cannot bind to hDaxx are unable to induce immediate-early gene expression and are severely attenuated for viral replication. These results indicate that the interaction between the human cytomegalovirus UL82 gene product (pp71) and hDaxx regulates immediate-early gene expression and viral replication.     

Nuclear domain 10 components promyelocytic leukemia protein and hDaxx independently contribute to an intrinsic antiviral defense against human cytomegalovirus infection

Infection with DNA viruses commonly results in the association of viral genomes with a cellular subnuclear structure known as nuclear domain 10 (ND10). Recent studies demonstrated that individual ND10 components, like hDaxx or promyelocytic leukemia protein (PML), mediate an intrinsic immune response against human cytomegalovirus (HCMV) infection, strengthening the assumption that ND10 components are part of a cellular antiviral defense mechanism. In order to further define the role of hDaxx and PML for HCMV replication, we generated either primary human fibroblasts with a stable, individual knockdown of PML or hDaxx (PML-kd and hDaxx-kd, respectively) or cells exhibiting a double knockdown. Comparative analysis of HCMV replication in PML-kd or hDaxx-kd cells revealed that immediate-early (IE) gene expression increased to a similar extent, regardless of which ND10 constituent was depleted. Since a loss of PML, the defining component of ND10, results in a dispersal of the entire nuclear substructure, the increased replication efficacy of HCMV in PML-kd cells could be a consequence of the dissociation of the repressor protein hDaxx from its optimal subnuclear localization. However, experiments using three different recombinant HCMVs revealed a differential growth complementation in PML-kd versus hDaxx-kd cells, strongly arguing for an independent involvement in suppressing HCMV replication. Furthermore, infection experiments using double-knockdown cells devoid of both PML and hDaxx illustrated an additional enhancement in the replication efficacy of HCMV compared to the single-knockdown cells. Taken together, our data indicate that both proteins, PML and hDaxx, mediate an intrinsic immune response against HCMV infection by contributing independently to the silencing of HCMV IE gene expression.