杨树基因工程进展

本文重点对杨树的遗传转化技术进行了概述,讨论了影响农杆菌转化效果的主要因素,并综述了杨树在抗除草剂、抗虫和抗病等方面基因工程进展状况。     

影响农杆菌介导的杨树遗传转化技术的因素

杨属树种是农杆菌的天然寄主之一,但木本植物一般再生能力较差,如何提高杨树的遗传转化频率就成为目前研究者最为关心的问题。本文结合农杆菌介导杨树遗传转化研究的最新进展和我们的实际工作对农杆菌的遗传转化原理、转移方法、以及影响农杆菌转化的因素进行了全新而深入的论述,并针对如何提高木本植物的转化频率,提出了一些改良的措施和方法。     

杨树腐烂病菌(Cytospora chrysosperma)原生质体遗传转化体系的构建

【目的】通过分析不同酶解条件对金黄壳囊孢菌[Cytospora chrysosperma(Pers.)Fr.]原生质体释放的影响,建立高效制备原生质体及其遗传转化体系的方法,为开展杨树腐烂病菌的致病分子机制研究奠定基础。【方法】以杨树腐烂病菌菌株CFCC 89981为受体,在细胞壁降解酶作用下产生用于转化所需的原生质体,通过PEG(Polyethylene glycol)介导将g GFP DNA导入杨树腐烂病菌的原生质体中获得转化子。经PCR扩增、Southern blot和荧光观察验证g GFP DNA插入到杨树腐烂病菌基因组中并表达出GFP(Green fluorescent protein)蛋白。【结果】以p H 5.5的1.2 mol/L KCl为稳渗剂,杨树腐烂病菌菌丝经Driselase和Lysing enzymes共同酶解4 h可获得1.2×108个/m L原生质体,再生率可达63.74%±9.73%,FDA(Fluorescein diacetate)溶液染色结果显示98%左右的原生质体具有较高的活力。利用PEG介导的遗传转化方法,转化效率可达76个/μg DNA。PCR检测和Southern blot均可在转化子基因组中检测到GFP基因片段,且荧光检测转化子的菌丝均呈绿色荧光,表明GFP基因在杨树腐烂病菌中表达。此外,GFP转化子在无潮霉素抗性的PDA培养基中多代转接后仍稳定遗传并表达GFP蛋白。【结论】通过筛选酶解条件,获得高质量、高活性的杨树腐烂病菌原生质体,并利用PEG介导的转化方法建立了高效稳定的原生质体遗传转化体系。该体系的建立为杨树腐烂病菌的后续研究奠定了技术基础。     

杨树抗冻性的研究现状

杨树是世界上广泛栽培的重要造林树种之一,我国是世界上杨树资源丰富的国家,杨树具有速生丰产、实用性强、无性繁殖能力强,且基因组较小等特点,现已成为研究林木生理和基因工程研究的模式植物。本文概述了国内外有关杨树抗冻性的生理生化性质及其指标、天然杂种的选择以及人工杂交选育种等方面研究现状,并展望了杨树基因工程在杨树抗冻性遗传改良中的应用前景,此外,对信后如何开展杨树抗冻改良育种的研究提出了一些设想。     

杨树抗冻性的研究现状

杨树是世界上广泛栽培的重要造林树种之一,我国是世界上杨树资源丰富的国家。杨树具有速生丰产、实用性强、无性繁殖能力强,且基因组较小等特点,现已成为研究林木生理和基因工程研究的模式植物。本文概述了国内外有关杨树抗冻性的生理生化性质及其指标、天然杂种的选择以及人工杂交选育种等方面研究现状,并展望了杨树基因工程在杨树抗冻性遗传改良中的应用前景。此外,对今后如何开展杨树抗冻改良育种的研究提出了一些设想。     

毛白杨叶外植体的遗传转化

参考 Horsch 等(1985)建立的叶圆片转化法,建立了一个适合于杨树的遗传转化系统。本文所用的根癌农杆菌菌株含有一个经过改建的 Ti 质粒,这个质粒载有 T-DNA 的4号基因和 CAT 基因。利用毛白杨(Popular tomentosa)的叶外植体经该菌株感染后,培养3-4个星期后,在没有外源激素的 MS_u 培养基上,从叶外植体的边缘处再生出一些不正常的苗。这种苗呈典型的畸胎芽,把这种苗从外植体上切下并转到生根培养基上,在苗的基部生成大量的愈伤组织,但并不形成根,同时在愈伤组织上产生大量的芽。气相色谱法测定内源细胞分裂素的结果表明,转化苗的异戊烯基腺苷的含量是正常苗的14倍。纸电泳结果表明,转化苗均含有特异的胭脂碱。在加有60-100μg/ml 氯霉素的培养基上,转化苗可以正常生长,而未转化的苗在培养约40天后变白死去。用酚类物质水杨酸预处理农杆菌有助于提高转化频率。     

杨树的组织培养及其基因工程研究

杨树是林木基因工程的模式植物,在其组织培养过程中,试管苗的再生不仅与植株的基因型,年龄及组织的来源,状态等有关,还受许多外界因素如盐浓度及激素的种类与配比的影响,在杨树的转化过程中,DNA直接转移法和农杆菌介导法都有应用,但后者较为常用,组织培养及转化技术的日趋成熟,为杨树基因工程奠定了良好基础,本文对杨树组织培养,DNA转化方法及其基因工程进行了较为系统的概述。     

杨树的组织培养及其基因工程研究

杨树是林木基因工程的模式植物。在其组织培养过程中,试管苗的再生不仅与植株的基因型、年龄及组织的来源、状态等有关,还受许多外界因素如盐浓度及激素的种类与配比的影响。在杨树的转化过程中,DNA直接转移法和农杆菌介导法都有应用,但后者较为常用。组织培养及转化技术的日趋成熟,为杨树基因工程奠定了良好基础。本文对杨树组织培养、DNA转化方法及其基因工程进行了较为系统的概述。     

农杆菌介导的河北杨遗传转化体系的建立

以兼具生态和能源植物功能的木本模式植物——杨树(河北杨)为材料,研究了携带促生长基因(35S-DAS5)的根癌农杆菌载体介导的河北杨遗传转化若干因素对转化效果的影响。结果显示,较适宜的转化系统为预培养2-4 d,农杆菌菌液(OD600值为0.4)侵染20 min,共培养4 d,在含30 mg/L卡那霉素(Km)的培养基上诱导不定芽,生根培养基中Km的适宜浓度为10 mg/L。     

抗虫的转AaIT基因杨树的获得

通过根癌农杆菌叶盘法将构建在双元载体上的昆虫特异性神经蝎毒素AaIT基因转化至中国南方杨树N106(小叶杨×美洲黑杨,P.deltoides×P.simonii)中,共获得了62株再生植株。PCR分析及PCR产物Southernblotting的分析结果表明,AaIT基因整合在再生植株的基因组上。对部分转AaIT基因植株进行了杀虫实验,转基因植株A5对一龄舞毒蛾(Lymantriadispar)幼虫有明显的抗性,饲喂转基因杨树叶片的幼虫死亡率显著高于未转基因对照植株,其取食面积小,存活幼虫体重明显小于对照。ELISA分析证明了AaIT蛋白的表达。     

杨树重要品种(无性系)的AFLP指纹分析

品种的准确鉴定及其遗传相关性的了解对杨树育种和品种管理具有非常重要的意义。本试验采用AFLP对来自青杨组和黑杨组的21个重要杨树品种（无性系）的鉴定与遗传相关性进行了研究。结果显示,筛选的4对AFLP引物总共产生了181条多态性带,尤其是每对引物对每个品种都产生了独特的指纹图谱;聚类分析和多维尺度分析将试验材料大体上分为五类,结果不仅显示了组间不同品种的差异,而且大体上区分了我国原生品种和外来品种。本研究表明,所有品种都可被筛选的引物准确鉴定,遗传相关性的推断结果与它们的系谱或分类基本一致。另外,本研究还表明AFLP技术完全可用于大规模地构建杨树树种DNA指纹图谱、进行树种鉴定和遗传相关性的研究．     

西南地区古杨树遗传多样性的SSR分析

采用SSR分子标记技术,对采集于中国西南地区的7种15个群体共226株杨树古树的遗传多样性进行分析,以揭示杨树古树的遗传变异水平及其遗传关系,为该区域杨树古树资源的合理保护与利用提供依据。结果显示:(1)7对SSR引物组合共扩增出80个多态性位点;以有效等位基因数为标准,7种杨树之间的遗传多样性水平依次为:西南杨昌都杨康定杨藏川杨乡城杨川杨德钦杨;杨树种内群体间的遗传多样性依次表现为:乡城杨的稻城群体乡城群体雅江群体,西南杨的理塘群体乡城群体稻城群体,德钦杨的香格里拉群体德钦群体,昌都杨的芒康群体贡觉群体昌都群体,藏川杨的德钦群体芒康群体。(2)乡城杨和西南杨群体内近交系数(F_(is))分别为-0.024 6和-0.253 5,藏川杨、德钦杨和昌都杨的Fis分别为0.205 4、0.240 1和0.029 2;乡城杨、西南杨、藏川杨、德钦杨和昌都杨群体间的遗传分化系数(F_(st))分别为0.156 1、0.253 5、0.128 8、0.182 0和0.177 3;除西南杨群体间基因流N_m小于1外,乡城杨、藏川杨、德钦杨和昌都杨群体间的基因流N_m均大于1。(3)7种杨树古树的遗传相似系数介于0.089 0~0.691 0,平均为0.402 0;UPGMA及Bayesian聚类结果均显示,7个树种可以分为3个大组,即川杨与康定杨聚为一组,乡城杨与西南杨聚为一组,藏川杨、德钦杨和昌都杨聚为第3组;5种杨树古树的群体UPGMA聚类结果显示,除西南杨的理塘群体与乡城杨聚为一组外,各杨树古树种与群体间的聚类关系较为紧密。研究表明,西南地区杨树古树具有较为丰富的遗传多样性,且其遗传变异主要均存在于群体内不同个体之间,任何个体的丧失均会导致杨树古树遗传多样性的降低或丧失,故需要加强对该区域现存古树资源的保护。     

基因枪转化技术及其在禾谷类作物遗传转化中的应用

基因枪转化法广泛用于禾谷类作物的遗传转化研究,是目前禾谷类作物遗传转化的有效方法。简要介绍了基困枪转化法的产生与发展、转化的特点以及影响转化频率的主要因素;系统地概述了基因枪法在禾谷类作物遗传转化的应用。     

小麦的遗传转化

概述了小麦遗传转化的发展历史与现状,分析了几种小麦转化技术的优势和不足,并对小麦遗传转化中的有关问题作了展望。     

遗传转化技术在柑桔育种中的研究进展

本文概述了遗传转化技术在柑桔育种中的研究进展,主要内容包括：遗传转化的常用方法,柑桔遗传转化研究的现状,柑桔遗传转化研究中存在的主要问题及发展前景     

基因枪在水稻遗传转化中的应用及其转化技术的优化

1983年Zambryski等人用根瘤农杆菌介导法进行烟草基因转移,获得了世界上首例转基因植株.随后,应用DNA直接导入技术如电击法(electroporation)和PEG介导法(PEG—mediated)成功地获得了转基因水稻植株.近年来,随着基因枪技术的建立和发展,水稻遗传转化成功的报道逐年增多.目前基因枪技术在植物遗传转化中的应用超过了根瘤农杆菌介导和其它转化方法的应用.这是因为基因枪转化技术不受植物种类的限制,不需要以原生质体作为转化的受体,可以将外源基因直接导入细胞、组织或器官,因而克服了根瘤农杆菌     

叶绿体遗传转化的研究

叶绿体的遗传转化是近几年发展起来的新领域。本文主要介绍了叶绿体遗传转化的特点、基本原理和外源基因转化叶绿体的方法与技术;综述了国外在此方面的研究进展及最新成就,以及叶绿体遗传转化体系在基础研究和生物技术领域中的应用。     

杨树重要品种( 无性系) 的AFLP 指纹分析

品种的准确鉴定及其遗传相关性的了解对杨树育种和品种管理具有非常重要的意义。本试验采用AFLP对来自青杨组和黑杨组的21 个重要杨树品种( 无性系) 的鉴定与遗传相关性进行了研究。结果显示, 筛选的4对AFLP 引物总共产生了181 条多态性带,尤其是每对引物对每个品种都产生了独特的指纹图谱; 聚类分析和多维尺度分析将试验材料大体上分为五类, 结果不仅显示了组间不同品种的差异, 而且大体上区分了我国原生品种和外来品种。本研究表明, 所有品种都可被筛选的引物准确鉴定, 遗传相关性的推断结果与它们的系谱或分类基本一致。另外, 本研究还表明AFLP 技术完全可用于大规模地构建杨树树种DNA 指纹图谱、进行树种鉴定和遗传相关性的研究。     

向日葵遗传转化研究进展

综述了PEG、基因枪和农杆菌介导的转化方法应用于向日葵遗传转化研究所取得的进展,并对影响向日葵遗传转化效率的因素和研究前景进行了探讨。     

丝状真菌基因工程研究进展

本文评述了丝状真菌基因工程的研究进展,内容涉及已被转化成功的９０余种丝状真中类及其所利用的选择标记,比较了几种外源ＤＮＡ进入丝状真菌受体的方法,并较为详细地评述了丝状真菌复制型与整合型转化及其转化子的有性生殖与无性生殖的遗传稳定性,最后,展望了丝状真菌基因工程在农业,工业和医药方面的应用。表明了丝状真菌基因工程具有广阔的应用前景。