核酸恒温扩增技术研究进展

核酸恒温扩增技术在生命科学研究及相关诸多领域已经得到了广泛应用。我们对核酸恒温扩增技术的最新进展作一简要综述,包括环介导恒温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列的扩增、滚环扩增、切口酶核酸恒温扩增、依赖解旋酶的恒温扩增、转录依赖的扩增、杂交捕获法、转录介导的扩增等的原理、优缺点及应用。     

等温核酸扩增技术在病原体检测中的应用

近年来,新型传染病相继爆发,如严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）、H7N9禽流感等,严重威胁着人类健康和社会、经济的可持续发展,同时给传染病的防控带来了严峻挑战。病原体检测是传染病防控的重要环节,越来越多的新技术被应用其中。等温核酸扩增技术作为一种快速、灵敏度高的病原体检测技术,已取得了长足发展。对等温核酸扩增技术的原理、重要特性及其在病原体检测中的应用进展进行了较为全面的综述,以期为这一技术的推广和应用提供重要参考。     

基于微流控芯片的核酸等温扩增技术研究进展

核酸等温扩增技术是一种在恒温体系内对核酸进行高效扩增的分子扩增技术,它能够在短时间内实现目的基因的指数增长.微流控芯片(microfluidic chip)技术是把研究样品制备、核酸富集、纯化和检测等多个操作步骤集成到一块“微型化”的芯片上,经自动化处理,得出实验结果,即“样品进,结果出”.将核酸等温扩增技术与微流控芯...     

滚环复制技术的建立及在RNA病毒基因检测中的初步应用

滚环复制是噬菌体繁殖所采取的一种基因复制方式,这种方式可使单链的环形分子在聚合酶和引物的作用下进行体外自我扩增。本文中用可特异性连接环化的寡核苷酸链作为探针,分别进行了1份细胞培养的禽流感病毒H5N1亚型样品、1份细胞培养的SARS病毒样品和4份丙型肝炎病毒阳性血清样品的检测。检测原理是探针与靶序列杂交后便可在T4DNA连接酶的作用下形成滚环复制中的环化单链分子,该分子在同温下可被特异性引物滚动复制和支链扩增。本文还利用按禽流感病毒NA1基因区序列合成的模拟DNA分子对该检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示：利用固相RCA技术成功检测到三种RNA病毒的基因,该方法的灵敏度可达到能检测10^3拷贝模式DNA分子的水平。与传统的PCR方法敏感性的比较尚待进一步研究。     

快速检测HBV DNA的环状介导等温DNA扩增法

环状介导等温DNA扩增（LAMP）技术是一种新的核酸扩增方法,它能够高特异性、高效、快速地进行核酸的扩增。利用LAMP法检测乙型肝炎病毒（HBV）,能够在等温条件下于1h内将少量的基因拷贝数扩增至10^9,在对65份临床标本的检测中显示了较高的特异性。与现有的PCR技术相比,LAMP法更加简便快速,且在等温条件下进行,不需要复杂的仪器设备,为临床检测乙肝病毒提供了一个快速筒便的新方法。     

环介导等温基因扩增技术及其在病毒检测中的应用

环介导等温扩增是一门新兴的分子生物学检测技术,因其具有特异性高、敏感性高、简单、快捷及不需要昂贵的仪器设备等特点,受到了生物医学研究者的高度关注。目前,该方法已经被广泛应用于各种病原微生物检测。简要综述了环介导等温扩增技术的原理、特点,及其在病毒检测中的应用。     

环介导的恒温扩增技术及其在病毒性疾病诊断中的应用

环介导的恒温扩增（LAMP）是近年来新兴的一种快速DNA扩增技术,其基本原理在于利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下对靶序列进行扩增。LAMP技术具有特异性强、敏感性高、反应迅速、设备简单等特点,在人类病毒性疾病的诊断领域有着广泛的应用。     

环介导等温可视扩增检测牛分枝杆菌方法的建立

目的:建立一种快速简便检测牛分枝杆菌的方法。方法:根据已发表的牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成6对特异扩增牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,通过条件优化,建立针对牛分枝杆菌的环介导等温扩增(LAMP)检测法,测定其特异性和敏感性,并对采集的牛临床样品的DNA分别进行检测。结果:采用该法只检出牛分枝杆菌,检测的最低拷贝数为1×102拷贝/μL。结论:建立的LAMP方法简便、快速、特异性高,可用于临床上牛分枝杆菌的快速检测。     

植物青枯病菌环介导等温扩增快速检测技术研究

为实现植物青枯病的早期诊断,需要建立一种适于田间快速便捷检测青枯病菌的方法。以细胞色素C基因为靶标设计一套特异性引物,建立了植物青枯病的LAMP检测方法。此方法最低检测极限为1 pg,可在1 h内完成,不依赖昂贵复杂的仪器,结果可经肉眼观察。利用此方法,在人工接种发病的茄子、番茄、花生、芝麻和凹头苋茎部浸出液和马铃薯病薯块茎组织液中均检测出青枯病菌的存在,尤其适用于田间疑似罹病的芝麻、花生、番茄、马铃薯和甘薯等植株的检测,且LAMP法的检出率远高于PCR法。应用LAMP技术检测青枯病菌快速高效、特异性强、灵敏度高,操作简单,适于在基层推广运用。     

牡蛎单孢子虫环介导等温扩增可视化检测方法的建立

目的:建立基于环介导等温扩增(LAMP)技术的单孢子虫可视化检测方法。方法:根据尼氏单孢子虫的小亚基核糖体RNA保守序列,设计一套特异性LAMP引物,对反应条件如温度和试剂浓度进行优化,建立检测牡蛎单孢子虫的LAMP方法。结果:所建立的方法的敏感性可达1 fg,是常规PCR方法的100倍;全部反应可在1 h内完成;可通过肉眼观察颜色,直接判定结果;对其他牡蛎常见病原体的检测结果均为阴性。结论:建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于牡蛎单孢子虫感染的快速检测。     

空肠弯曲菌LAMP快速检测方法的建立

本研究使用恒温环介导技术, 以空肠弯曲菌的促旋酶基因A(gyrA)设计引物, 建立空肠弯曲菌的LAMP快速检测方法。不同来源的4株空肠弯曲菌LAMP检测均显示阳性, 其他14种细菌LAMP检测显示阴性。实验结果表明, 设计的引物具有良好的特异性。本研究进行了LAMP检测方法与细菌平板计数法和PCR法的灵敏度比较, 结果LAMP检测与PCR法有相近的灵敏度, 比细菌平板计数法灵敏度高3个数量级。我们还研究发现提取核酸前加入DNase可以有效地减少死菌DNA对LAMP结果的影响。使用LAMP方法对鸡法氏囊的检测表明, 结合核酸提取步骤中的DNase处理步骤, 可以准确的检测出鸡法氏囊中的空肠弯曲菌。     

环介导等温扩增技术在致病微生物检测中的应用

环介导等温扩增(LAMP)是一种新兴的核酸扩增方法,由于其具有高灵敏、高特异、操作简单、检测快速、价格低廉等诸多优势,现已成为分子生物学诊断技术的重要组成部分,并广泛应用于基层实验室及野外致病微生物的在快速检测致病微生物中的应用及新进展,希望能为其发展提供参考。     

环介导恒温扩增法快速检测海产品中的副溶血弧菌

副溶血弧菌广泛分布于海水或海产品中,人类摄入或接触污染的水源和食物易引起感染。近年来,有关致病性弧菌引起腹泻的报道逐渐增多,但GB标准的细菌学诊断方法检测周期长达1周左右,而且操作较为复杂,难以满足控制疾病暴发和传播的需要,就这一现状,建立了一套不仅快速、准确,而且操作简便、不依赖昂贵仪器的检测方法,应用于海产品中副溶血弧菌快速检测。采用环介导恒温扩增方法(LAMP),针对副溶血弧菌的gyrB基因设计特异引物,进行恒温扩增。使用该方法最低检出限达到101CFU/mL,灵敏度可以达到0.1pg副溶血弧菌基因组DNA,为海产品中副溶血弧菌的检测提供了一个新的辅助方法。     

环介导恒温扩增法快速检测短小芽孢杆菌

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)是一种能引起食源性疾病的腐败菌,对其进行快速检测具有重要意义。针对短小芽孢杆菌木聚糖(xynA)基因,设计了4条特异性引物(两条内引物和两条外引物),通过条件优化,首次将一种新颖的核酸扩增技术——环介导恒温扩增技术应用于短小芽孢杆菌的快速检测。采用该技术,63℃温育1h的条件下扩增短小芽孢杆菌DNA,琼脂糖凝胶电泳得到特异性梯度条带。PCR和LAMP的检测灵敏度分别约为162和16.2拷贝每反应。结果表明,该方法检测短小芽孢杆菌特异性强、灵敏度高、操作简便、检测成本低,1h即可完成,有望发展成为快速检测短小芽孢杆菌的有效手段。     

环介导等温扩增技术的研究进展

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新式核酸扩增技术,它依靠一种具有链置换活性的DNA聚合酶和2对特殊设计的引物,不需要反复的温度循环和昂贵的仪器设备,在等温条件下即可高效快速地完成扩增反应,目前已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测,及动物胚胎性别的鉴定。该文总结了LAMP技术的基本原理、相对于传统核酸检测技术的优点、产物的检测方法及其临床应用,最后指出LAMP目前存在的不足以及采取的相应措施,并对其发展前景进行了展望。     

牛病毒性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立

目的:建立牛病毒性腹泻病毒(BVDv)的环介导体外等温扩增(LAMP)快速检测方法。方法:根据BVDv的5'端非编码区序列,在保守区的8个位点设计LAMP特异性引物(2对特异性引物和1对环引物),对反应条件和试剂浓度进行优化,建立恒温(63.5℃)、快速(65min)的检测方法。结果:建立的方法特异性好,检测其他对照病毒均为阴性;灵敏度高,最低可检测到1个拷贝的阳性质粒,可通过观察浑浊度或加入染料后直接判定扩增结果。结论:建立了用于检测BVDv的LAMP方法,该方法简便、快速、特异性好、灵敏度高,适合基层和现场检测。     

鸭瘟病毒LAMP可视化检测方法的建立

目的:建立一种快速、简便、特异性高的鸭瘟病毒(DPV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法。方法:根据Gen Bank中DPVUI6基因的保守序列设计一套特异性引物,并对反应条件进行优化,建立DPV的LAMP可视化检测方法。结果:建立的LAMP方法对其他鸭常见病原体无扩增反应;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;敏感性可达0.1fg,是常规PCR方法的100倍;扩增反应只须在常规水浴锅中进行,可在1 h内完成。结论:建立的DPV LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于DPV感染的快速检测。     

单管可视化环介导等温扩增技术快速检测恶性疟原虫

目的:建立一种基于环介导等温核酸扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)的恶性疟原虫高灵敏可视化闭管检测方法。方法:针对恶性疟原虫核糖体DNA的序列保守区设计LAMP引物,通过优化LAMP体系中的Mg2+、甜菜碱浓度和反应温度等因素,建立环介导等温扩增法;并结合蜡封反应管对产物进行检测,检测结果可直接通过肉眼观察SYBR Green I荧光显色进行判定。结果:本方法可检测到70个拷贝/管的恶性疟原虫核酸片段,并具有高特异性,可区分检测常见的血液病毒。该法具有如下优点:1、整个反应恒温进行,无需热循环仪;2、闭管检测,极大降低了扩增产物交叉污染的风险;3、检测速度快,整个检测过程只需30 min。结论:该法的建立为恶性疟原虫的现场快速筛检提供了一种简便、高灵敏、高特异的工具。     

环介导等温扩增核酸技术及其在食品安全检测领域的应用

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,简称LAMP)是利用能识别靶序列上6个位点的4个特殊设计的引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下,特异、高效、快速地扩增核酸的新技术。该技术在1h内扩增效率可达到109-1010个数量级,扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物,电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。近年来LAMP技术以其特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点已经应用于食品安全检测领域的多个方面。     

普通牛及其近缘种特异性序列筛选及环介导等温扩增检测方法

近年来,肉制品掺假事件频频发生,亟需建立快速、可靠的肉制品动物源性成分检测方法,保障肉类食品安全。与常规PCR等检测方法相比,环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法具有高特异性、高灵敏度、反应快、易操作等优势。基于此,利用生物信息算法筛选普通牛及其近缘种（牦牛、水牛、美洲野牛）的全基因组序列,以获得种间相似性序列,进而建立并优化可用于检测普通牛及其近缘种成分的特异性LAMP方法。最终优化后的LAMP反应体系为：10 μmol·L-1外引物F3和B3各0.25 μL,10 μmol·L-1内引物FIP和BIP各2 μL,2 mmol·L-1 dNTP 2.5 μL,25 mmol·L-1 MgSO4 4 μL,5 mol·L-1 甜菜碱 3.5 μL,8.0 U·μL-1 Bst DNA 聚合酶 1 μL,10×ThermoPol Buffer 2.5 μL,DNA模板2 μL,加双蒸水至25 μL;LAMP反应条件为：65 ℃恒温扩增1 h,80 ℃ 10 min。在扩增产物中加入SYBR GreenⅠ荧光染料后,检测结果可用肉眼直接观察。优化后的LAMP方法在1 h内能特异性地检测出普通牛、牦牛、水牛及美洲野牛成分,检测灵敏度达到0.020 ng·μL-1,且可特异性地检测出市售肉制品中含有牛肉成分的样品。研究所建立的LAMP方法具有高特异性、高灵敏度、反应快速、操作简便和无需精密仪器等特点,可应用于肉制品中普通牛及其近缘种成分的实际检测,为我国肉类食品安全提供了有力保障。