H2O2致WB-F344细胞内活性氧的产生及机理

以双氢罗丹明123（DHR123）作为荧光探针,采用激光共聚焦扫描显微镜研究小剂量（800nmol/L)H2O2诱导大鼠肝卵细胞株WB－F344细胞内活性氧产生的动态变化过程及其机理。结果发现：（1）小剂量H2O2的一次作用可以引起胞内活性氧的产生;（2）胞内活性氧清除剂N－乙酰－L－半胱氨酸（NAC）处理2h时后,再加入小剂量H2O2,发现胞内活性氧的产生明显减少;（3）用广谱的蛋白激酶抑制剂2－氨基嘌呤（2－AP）、Ca^2 依赖性蛋白激酶（PKC）抑制剂Bisindolylmaleimide Ⅰ、酷氨酸蛋白激酶（TPK）抑制剂Tyrphostin25分别预处理15min后,H2O2诱导的胞内活性氧的产生现象均消失;（4）细胞在无外钙环境下,小剂量H2O2诱导的胞内活性氧的产生明显减少;（5）细胞在无外钙环境下用NAC预处理后,H2O2诱导的胞内活性氧的产生现象消失。结果表明,H2O2可以通过胞内信号转导系统诱使WB细胞胞内活性氧产生,这可能与小剂量H2O2调控细胞生物学功能（如增殖、转化）相关。     

拟南芥保卫细胞中茉莉酸甲酯诱导的H2O2产生与MAPK信号转导体系的可能关系

蛋白激酶MEK1/2的专一抑制剂PD98059可抑制茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的拟南芥保卫细胞中H2O2的产生和气孔的关闭.MeJA和H2O2诱导气孔关闭后,再用PD98059处理,可使关闭的气孔重新开放,同样,外源PD98059处理,能使MeJA诱导增强的H2O2探针的荧光强度降低.此结果表明,类属于MAPKK的蛋白激酶MEK1/2参与了MeJA诱导的拟南芥气孔关闭的信号转导过程,其作用机制可能是通过调节MeJA诱导保卫细胞产生和积累H2O2而起作用.     

大蒜素激活SIRT1通路抑制过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞的衰老

Sirtuin1(SIRT1)活性的异常与血管内皮细胞的衰老密切相关。大蒜素作为一种生物活性分子具有抗氧化、抗炎及调脂作用,然而目前尚未见关于大蒜素与SIRT1的活性调节的报道。本研究旨在阐明大蒜素对过氧化氢（H2O2）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）衰老的影响,以及Sirtuin1(SIRT1)在其中的作用。SA-β-gal染色及活性氧检测提示,与对照组相比,大蒜素明显减少H2O2诱导半乳糖苷酶阳性细胞数及活性氧的产生。用Western印迹、MTT、RT-PCR及SIRT1活化检测对SIRT1、p-SIRT1、PAI-1的蛋白质、SIRT1mRNA表达及细胞活力进行检测,结果显示,大蒜素可以逆转H2O2诱导的PAI-1表达的升高、SIRT1磷酸化及活性的降低,并且上调细胞的活力。当采用SIRT1抑制剂NAM处理后,大蒜素的这些作用均被阻断。以上结果表明,大蒜素通过激活SIRT1抑制H2O2诱导的HUVECs ROS的产生、活力的下降及细胞的衰老。     

3-氨基苯酰胺对氧化应激诱导的HeLa细胞端粒DNA链断裂重连接作用的影响

端粒是位于真核细胞染色体末端的DNA-蛋白质复合体,在维持染色体稳定上起着重要的作用,并且与细胞的衰老和凋亡有着密切的关系.在各种DNA损伤中,单链断裂(single-strand breaks, SSBs)是最常见的类型之一,既可直接通过内源活性氧或离子化辐射产生,也可间接地在DNA代谢或碱基切除修复期间产生.已知多聚(ADP-核糖)聚合酶［poly(ADPribose) polymerase, PARP］在SSBs修复中起着极为重要的作用.本实验观察了PARP抑制剂3-氨基苯酰胺(3-aminobenzamide, 3-AB)对氧化应激诱导的HeLa细胞端粒DNA链断裂重连接的效应以及对过氧化氢(H2O2)抑制HeLa细胞增殖的影响.结果表明3-AB能够显著地抑制氧化应激诱导的HeLa细胞端粒DNA链断裂后的重连接作用,并能增强H2O2对HeLa细胞增殖的抑制作用,提示PARP参与了端粒DNA链断裂损伤的修复过程.     

一氧化氮在脱落酸诱导的玉米叶片亚细胞抗氧化防护中的作用

研究了ABA诱导NO产生的来源以及NO在ABA诱导的玉米叶片H2O2累积和亚细胞水平抗氧化中的作用。ABA诱导玉米叶片NO的产生以及NOS活性增加,NOS抑制剂抑制这种增加。NO清除剂和NR抑制剂预处理也抑制了ABA诱导的NO产生,但是并不影响ABA诱导的NOS活性,结果提示了ABA诱导的NO的产生来源于NOS和NR2条途径。NO清除剂、NOS抑制剂和NR抑制剂预处理抑制了ABA和H2O2诱导的抗氧化防护酶基因SOD4、cAPX、GR1的表达和叶绿体及细胞溶质抗氧化酶活性的增加,表明NO参与ABA和H2O2诱导的玉米亚细胞抗氧化防护系统。另一方面,以NO供体SNP预处理减少了ABA诱导的H2O2的累积,而c—PTIO逆转了SNP减少ABA诱导的H2O2累积的作用。SNP处理诱导了亚细胞抗氧化酶活性的增加,用c—PTIO预处理抑制了这种增加。实验结果表明ABA诱导H2O2和INO产生,NO上调了玉米亚细胞抗氧化防护酶活性,进而防止玉米叶片中H2O2的过量累积。因此在玉米ABA诱导的信号转导中有一个NO和H2O2负反馈环。     

低温诱导绿豆黄化幼苗乙烯产生过程中活性氧的作用

低温明显诱导绿豆 (PhaseolusradiatusL .)黄化幼苗乙烯产生速率的升高 ,同时也诱导活性氧产生速率不同程度的提高 ,显示二者之间有密切的关系。乙烯合成抑制剂AVG (2 aminoethoxyvinlglycine)、AOA(aminooxyaceticacid)能明显减弱低温对绿豆黄化幼苗乙烯产生的诱导作用 ,但对活性氧的产生没有明显的影响 ,说明低温诱导的乙烯产生的增加并不是活性氧产生增加的原因。超氧阴离子自由基 (O- ·2 )的特异性清除剂SOD和DABCO(1,4 diazabicyclo 2 ,2 ,2 octane)能有效削弱低温对乙烯产生的诱导作用 ,外源O- ·2 产生系统明显促进经过低温处理的幼苗回到常温下生长初期乙烯产生的增加 ,说明O- ·2 产生的增加可能是低温诱导乙烯产生增加的原因之一。低温诱导的H2 O2 产生的增加则被证明与乙烯产生速率的升高没有直接关系。     

UV-B对拟南芥叶片不同来源H2O2的活化和气孔关闭的诱导

在UV-B调控植物许多生理过程中过氧化氢(H2O2)作为第二信使发挥着重要作用,但H2O2来源途径并不清楚。该研究借助气孔开度分析和激光扫描共聚焦显微镜技术,探讨H2O2在介导不同剂量UV-B诱导拟南芥叶片气孔关闭过程中的酶学来源途径。结果发现:0.5W.m-2 UV-B能诱导野生型拟南芥叶片保卫细胞的H2O2产生和气孔关闭,且该效应能被NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘(DPI)抑制,而不能被细胞壁过氧化物酶抑制剂水杨基氧肟酸(SHAM)抑制,同时该剂量UV-B也不能诱导NADPH氧化酶功能缺失单突变体AtrbohD和AtrbohF以及双突变体AtrbohD/F保卫细胞的H2O2产生和气孔关闭;相反,0.65 W.m-2 UV-B既能诱导野生型也能诱导NADPH氧化酶突变体保卫细胞的H2O2产生和气孔关闭,且该效应能被SHAM抑制,却不能被DPI抑制。结果表明,不同剂量UV-B通过活化不同生成途径的H2O2来诱导拟南芥叶片气孔关闭,即低剂量UV-B主要诱导NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF途径来源的H2O2生成,而高剂量UV-B主要活化细胞壁过氧化酶途径来源的H2O2。     

刺梨黄酮的体外抗氧化作用

利用化学发光及分光光度法研究了刺梨黄酮对活性氧自由基O2-.,H2O2,DPPH·的清除作用,以及对H2O2诱导的红细胞氧化溶血和肝组织脂质过氧化产物(MDA)形成的抑制作用。结果表明,刺梨黄酮能很好地清除各种活性氧,并能显著抑制红细胞氧化溶血以及肝组织MDA的产生。提示其是一种很好的抗氧化剂。     

质膜NADPH氧化酶的活化与H2O2的产生介导内源激发子诱导人参悬浮细胞中PAL活性的提高与人参皂甙的积累

利用纤维素酶降解人参(Panax ginseng C.A.Meyer)悬浮细胞的细胞壁制备了内源激发子(CDW).CDW体外诱导了游离人参细胞质膜NADPH氧化酶的活性,激发了活体人参悬浮细胞产生H2O2.CDW还可以诱导提高苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,促进人参鲨烯环氧酶基因(sqe)的转录与人参皂甙的积累.NADPH氧化酶的抑制剂不仅可以抑制CDW体外诱导的质膜NADPH活性而且还可以抑制CDW诱导人参细胞产生H2O2.进而,这些抑制剂还可以抑制CDW诱导PAL活性的提高,以及sqe的转录与人参皂甙的合成.过氧化氢酶与H2O2的粹灭剂也可以抑制CDW激发产生的这些诱导效应.上述结果表明CDW激发质膜NADPH氧化酶的活化与H2O2的产生在介导CDW诱导人参细胞抗性反应中,包括PAL活性的提高与人参皂甙的积累,起了重要的信号转导作用.     

H_2O_2和MAPK介导油菜素内酯诱导番茄抗氧化防护酶SOD和CAT的信号途径

本文以番茄为材料,研究H2O2和MAPK在BR诱导的抗氧化防护系统中的作用。结果表明,外源BR提高抗氧化防护酶SOD和CAT活性;而这种诱导机制被H2O2产生抑制剂二苯基碘（DPI）和MEK1/2专一抑制剂PD98059阻断。进一步研究发现：BR能够诱导细胞质外体H2O2的产生,这种诱导被PD98059抑制;BR能够活化一种49kDaMAPK,这种活化被DPI抑制。本研究结果证实细胞质外体H2O2和MAPK候选激酶（49kDaMAPK）信号参与BR诱导的抗氧化防酶途径,且两者之间存在交互作用。     

大丽轮枝菌毒素与拟南芥互作反应中SA、NO与H2O2信号的相关性

本文研究了大丽轮枝菌毒素(VD-toxin)与拟南芥互作反应中外源SA、NO供体、NO合酶抑制剂等对拟南芥幼苗H2O2含量的影响,并对H2O2的积累部位进行了DAB组化染色检测.大丽轮枝菌毒素、外源SA、NO供体处理拟南芥幼苗均能诱导H2O2的积累,NO供体的诱导作用最强;NO合酶抑制剂处理则未表现出H2O2含量的增强;H2O2的积累部位主要在叶片的表皮毛和维管束组织.结果表明,在大丽轮枝菌毒素与拟南芥互作反应中,H2O2可能作为信号分子参与了SA和NO调控的拟南芥防卫反应,NO信号与H2O2信号间的关系可能更密切.     

Multiple signalling pathways mediate fungal elicitor-induced beta-thujaplicin biosynthesis in Cupressus lusitanica cell cultures

The biosynthesis of a phytoalexin, beta-thujaplicin, in Cupressus lusitanica cell cultures can be stimulated by a yeast elicitor, H(2)O(2), or methyl jasmonate. Lipoxygenase activity was also stimulated by these treatments, suggesting that the oxidative burst and jasmonate pathway may mediate the elicitor-induced accumulation of beta-thujaplicin. The elicitor signalling pathway involved in beta-thujaplicin induction was further investigated using pharmacological and biochemical approaches. Treatment of the cells with calcium ionophore A23187 alone stimulated the production of beta-thujaplicin. A23187 also enhanced the elicitor-induced production of beta-thujaplicin. EGTA, LaCl(3), and verapamil pretreatments partially blocked A23187- or yeast elicitor-induced accumulation of beta-thujaplicin. These results suggest that Ca(2+) influx is required for elicitor-induced production of beta-thujaplicin. Treatment of cell cultures with mastoparan, melittin or cholera toxin alone or in combination with the elicitor stimulated the production of beta-thujaplicin or enhanced the elicitor-induced production of beta-thujaplicin. The G-protein inhibitor suramin inhibited the elicitor-induced production of beta-thujaplicin, suggesting that receptor-coupled G-proteins are likely to be involved in the elicitor-induced biosynthesis of beta-thujaplicin. Indeed, both GTP-binding activity and GTPase activity of the plasma membrane were stimulated by elicitor, and suramin and cholera toxin affected G-protein activities. In addition, all inhibitors of G-proteins and Ca(2+) flux suppressed elicitor-induced increases in lipoxygenase activity whereas activators of G-proteins and the Ca(2+) signalling pathway increased lipoxygenase activity. These observations suggest that Ca(2+) and G-proteins may mediate elicitor signals to the jasmonate pathway, and the jasmonate signalling pathway may then lead to the production of beta-thujaplicin.     

NO和H2O2在光／暗调控蚕豆气孔运动中的作用及其相互关系

借助表皮条分析和激光扫描共聚焦显微镜技术,对NO和H_2O_2在光/暗调控蚕豆(Vicia faba L.)气孔运动中的作用及其相互关系进行了探索。结果显示,光下外源NO供体硝普钠(SNP)和H_2O_2促进气孔关闭的效应明显大于暗中,暗中NO专一性清除剂2,4-羧基苯-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(cPTIO)、一氧化氮合酶(NOS)抑制剂N~G-氮-L-精氨酸-甲酯(L-NAME)和H_2O_2清除剂抗坏血酸(Vc)、过氧化氢酶(CAT)对气孔开度的效应明显大于光下,而且光下蚕豆保卫细胞NO和H_2O_2水平比暗中明显降低。上述结果表明,光/暗通过影响保卫细胞NO和H_2O_2的水平调控气孔运动。研究还发现,光下H_2O_2既诱导NO水平增加,也诱导气孔关闭,cPTIO和L-NAME有效地逆转H_2O_2的这些效应;光下SNP既诱导H_2O_2水平增加,也诱导气孔关闭,SNP的上述效应又被Vc和CAT有效逆转。这些结果表明,NO和H_2O_2在生成及效应上均存在明显的相互作用。另外,L-NAME显著逆转暗和光下H_2O_2处理对气孔关闭和NO生成的效应表明,蚕豆保卫细胞中可能存在NOS,暗和光下H_2O_2处理可能通过提高NOS的活性促进NO水平增加,进而诱导气孔关闭。     

过氧化氢以PTEN依赖方式介导细胞凋亡

 PTEN是一个重要的抑癌基因.为了调查PTEN在H２Ｏ2对细胞凋亡诱导过程中的作用及机制,采用Western 印迹方法,检测了在PTEN缺失细胞及对照细胞中H２Ｏ2对PI3K/AKT通路的影响;采用Annexin Ⅴ-FITC标记结合流式检测H２Ｏ2对PTEN缺失细胞及对照细胞凋亡的诱导.结果表明,在PTEN功能正常的对照细胞中,H２Ｏ2短时间活化,长时间抑制PI3K/AKT通路,但PTEN缺失后,H２Ｏ2对PI3K/AKT通路的介导被阻断;0.1mmol/L H２Ｏ2处理12　h及24　h可以诱导对照细胞的凋亡,但对PTEN缺失细胞没有明显影响.这一结果证明,PTEN通过参与H２Ｏ2对PI3K/AKT通路活性的调控影响H２Ｏ2介导的凋亡.     

Reactive oxygen species, nitric oxide, and their interactions play different roles in Cupressus lusitanica cell death and phytoalexin biosynthesis

Beta-thujaplicin Is a natural troponoid with strong antifungal, antiviral, and anticancer activities. Beta-thujaplicin production in yeast elicitor-treated Cupressus lusitanica cell culture and its relationships with reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) production and hypersensitive cell death were investigated. Superoxide anion radical (O2*-) induced cell death and inhibited beta-thujaplicin accumulation, whereas hydrogen peroxide (H2O2) induced beta-thujaplicin accumulation but did not significantly affect cell death. Both elicitor and O2*- induced programmed cell death, which can be blocked by protease inhibitors, protein kinase inhibitors, and Ca2+ chelators. Elicitor-induced NO generation was nitric oxide synthase (NOS)-dependent. Inhibition of NO generation by NOS inhibitors and NO scavenger partly blocked the elicitor-induced beta-thujaplicin accumulation and cell death, and NO donors strongly induced cell death. Interaction among NO, H2O2, and O2*- shows that NO production and H2O2 production are interdependent, but NO and O2*- accumulation were negatively related because of coconsumption of NO and O2*-. NO- and O2*- -induced cell death required each other, and both were required for elicitor-induced cell death. A direct interaction between NO and O2*- was implicated in the production of a potent oxidant peroxynitrite, which might mediate the elicitor-induced cell death.     

Lipidomic analysis reveals differential defense responses of Taxus cuspidata cells to two elicitors, methyl jasmonate and cerium (Ce4+)

Methyl jasmonate (MeJA) and cerium (Ce(4+)) elicitation share common features of increasing taxol accumulation of Taxus cuspidata cells. Interestingly, Ce(4+) induces programmed cell death (PCD), but this phenomenon is not observed with MeJA elicitation. Here, using a lipidomic approach to measure more than 100 membrane glycerophospholipids of T. cuspidata cells quantitatively, we discovered that lysophosphatidylcholine (LysoPC), phosphatidic acid (PA) and phosphatidylcholine were three potential lipid markers that were responsible for the differences between Ce(4+)-induced cells and MeJA-induced cells. Compared with MeJA elicitation, marked increase of phospholipase D (PLD) activity was observed following Ce(4+) elicitation, suggesting that the PLD activation and high concentrations of PA production might mediate the PCD. Rapid increase of phospholipase A(2) (PLA(2)) activity caused the release of fatty acids and LysoPC following Ce(4+) elicitation, which enhanced endogenous jasmonic acid (JA) accumulation. In contrast, PLA(2) activity was poorly induced following MeJA elicitation. PLA(2) inhibitor suppressed not only JA accumulation but also taxol production, suggesting that the PLA(2) activation mediated Ce(4+)-induced taxol production partially through a JA-dependent signaling pathway. These results demonstrate that differential alternation of glycerolphospholipids caused by phospholipases constitutes an important step in cell death response to Ce(4+) and increasing taxol production.     

钙和硼对蓝猪耳花粉萌发及花粉管生长的影响

研究了钙(Ca^2 )和硼(H3BO3)对蓝猪耳花粉萌发和花粉管生长的影响。结果表明：(1)在一定范围内Ca^2 几乎不影响花粉萌发频率,而主要影响花粉萌发速度和花粉管生长速度;低Ca^2 不利于花粉管生长,而高Ca^2 抑制花粉萌发速度和花粉管生长;在稍高于最适Ca^2 浓度的条件下,花粉管生长早期呈现波浪形。(2)硼明显影响花粉萌发频率及花粉管形态;花粉管生长必需硼,但不同浓度的硼对花粉管生长速度影响不明显;在高浓度硼条件下,较长时间内花粉管均呈现出波浪形。(3)Cooled-CCD动态跟踪观察进一步证实Ca^2 影响花粉管生长速度,而硼则不明显。     

烟草悬浮细胞在凋亡过程中Ca2+分布的共聚焦显微成像研究

以Fluo-3AM为游离Ca²⁺荧光探针,利用激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM）对烟草悬浮细胞在热激诱导的凋亡过程中Ca²⁺时空分布进行了研究。结果显示,在正常细胞中,Ca²⁺集中分布在细胞壁和细胞核中,细胞质中分布较少;在凋亡早期细胞中,细胞质中Ca²⁺的浓度增加;在凋亡晚期的细胞中,细胞核中的Ca²⁺浓度增加较为明显。结果提示,在凋亡过程中,Ca²⁺的定位分布存在一定的规律。     

红光对绿豆下胚轴线粒体Ca~(2+)积累、ATPase及NAD激酶活性的影响

绿豆下胚轴切段经红光处理后10min,其线粒体的Ca~(2+)积累下降15％,Ca~(2+)-ATPase 及 Mg~(2+)-ATPase活性也分别下降29％和10％,切段CaM含量增加近1倍。Ca~(2+)存在时,红光能促进线粒体NAD 激酶活性。说明Ca~(2+)-ATPase及一部分Mg~(2+)-ATPase可作为钙泵控制Ca~(2+)进入线粒体。     

Ca2+提高白花苜蓿抗冷性的研究

Ca2 + 处理能缓解冷胁迫时白花苜蓿叶片叶绿素的降解速度 ,提高叶片中可溶性糖、脯氨酸和Vc的含量 ;还能保持冷胁迫时细胞膜透性的稳定 ,减少O 2 和MDA的积累 ;维持较高的SOD和POD的活性。