尼帕病毒融合蛋白和受体结合蛋白基因DNA免疫的研究

构建了表达哺乳动物密码子优化的NiV囊膜蛋白F和G基因的真核表达质粒pCAGG-NiV-F和pCAGG-NiV-G.细胞融合试验表明,重组NiV融合蛋白F和受体结合蛋白G在pCAGG-NiV-F、pCAGG-NiV-G共转染BHK细胞中获得表达,并具有良好生物学活性.真核表达质粒pCAGG-NiV-F、pCAGG-NiV-G和pCAGG-NiV-F pCAGG-NiV-G DNA分别按100μg/只的剂量肌肉注射免疫6周龄BALB/c小鼠,间隔4周加强免疫,第二次加强免疫3周后采血,分离血清备用.分别以重组杆状病毒感染Sf9细胞表达的重组NiV融合蛋白(rNF)和受体结合蛋白(rNG)为包被抗原,应用间接ELISA检测上述质粒DNA免疫血清中的特异性抗体,具有较高的敏感性和特异性.另外,中和试验结果表明,DNA免疫小鼠产生的特异抗体可有效中和NiV囊膜蛋白F和G介导的伪型VSV重组病毒侵入NiV易感宿主细胞的感染性,并且受体结合蛋白G基因DNA诱导中和抗体的滴度高于融合蛋白F基因DNA.结果表明,DNA疫苗具有防制尼帕病毒性脑炎的潜力.     

雌激素受体β表达载体的构建及其转录活性测定

为探索雌激素受体B(ERβ)在乳腺癌形成过程中的分子机制,构建出带HA标签的ERl3真核表达载体。首先将PCR扩增出的带HA标签的DNA片段连接到pcDNA3载体中,得到重组质粒pcDNA3-HA。再将ERβ完整编码区序列克隆到pcDNA3-HA中,得到重组质粒pcDNA3-HA—ERβ。Western印迹结果表明,转染pcDNA3-HA-ERβ重组质粒的293T细胞表达了与预期大小一致的HA—ERβ。用含雌激素应答元件的报告基因系统检测ERβ的转录活性表明。HA—ERβ在293T细胞中的表达激活了报告基因的表达。ERβ表达载体的成功构建为深入研究其生物学功能打下了坚实的基础。     

流感病毒NP表位序列增强H7N9 HA DNA疫苗免疫效果研究

为增强H7N9流感病毒HA DNA疫苗的免疫效果,本文构建了含有流感病毒NP的5个重复优势T表位或B表位(包括B_1线性表位和B_2构象表位)的表达质粒(简称NPT和NPB),以小鼠为动物模型,将NPT和NPB分别与H7N9流感病毒HA DNA混合免疫BALB/c小鼠1次,21 d后用致死剂量(20 LD_(50))的H7N9流感病毒攻击小鼠。通过检测免疫后小鼠血清特异性抗体滴度和攻毒后的免疫保护性指标-存活率、肺部残余病毒滴度及体重丢失率,评价表位质粒与HA DNA疫苗混合免疫对小鼠的保护效果。试验结果表明:用致死性H7N9流感病毒攻击小鼠后,HA DNA组小鼠全部死亡,HA+NPT免疫组小鼠存活率达到100%,HA+NPB1和HA+NPB2免疫组,小鼠存活率分别为30%和75%;混合免疫HA+NPT后小鼠抗体滴度升高明显,攻毒后小鼠体重丢失明显降低。综上表明,含有5个NP优势T表位或B表位的表达质粒能增强H7N9流感病毒HA DNA疫苗的免疫效果,混合免疫一次可以使小鼠得到较好的保护。HA DNA和表位疫苗的混合免疫,节约了疫苗用量,降低了免疫成本,为流感病毒核酸疫苗的临床开发提供了一定的试验基础。     

核酸免疫制备鼠抗棉铃虫FK506结合蛋白的多克隆抗体

利用电注射基因导入法制备小鼠抗棉铃虫FK506结合蛋白(FKBP12)的多克隆抗体,并通过Western blot验证抗体与抗原的特异性结合。构建重组质粒pc DNA3-FKBP12并测序验证序列的正确性,利用基因导入法将重组质粒pc DNA3-FKBP12注射到小鼠体内,免疫4次后用ELISA检测法确定抗体的效价,并对抗体的特异性结合进行Western blot以及免疫组化检测。结果表明,小鼠抗FK506结合蛋白血清的效价达到1∶25 600,Western blot结果显示此抗血清能与融合蛋白His-FKBP12结合,免疫组化结果表明在棉铃虫3龄幼虫不同组织中FKBP12均有表达。说明电注射基因导入法制备的小鼠抗FK506结合蛋白的抗体在滴度和特异性结合方面都达到预期要求。     

萤光素酶表达质粒pEE14.1-luc的构建及表达

目的:为研究10 kb以上DNA疫苗质粒的体内电穿孔递送,构建萤光素酶报告基因表达质粒p EE14.1-luc,并验证其表达。方法:从质粒p GL3-CMV中通过酶切、补平和纯化的方法获得萤光素酶基因luc,克隆入p EE14.1载体,构建重组表达质粒p EE14.1-luc,瞬时转染293T细胞,采用Western印迹、流式细胞术和免疫荧光等方法对萤光素酶基因在体外的表达情况进行验证,并运用活体成像仪检测萤光素酶基因在小鼠活体内的表达。结果:经菌液PCR鉴定和测序验证,p EE14.1-luc与预期设计完全一致;流式细胞术检测luc阳性表达率为22.41%,免疫荧光检测可见绿色荧光表达,Western印迹检测在相对分子质量为62×103处显现目的蛋白条带;同时,利用活体成像技术也检测到萤光素酶基因在小鼠活体内的表达。结论:p EE14.1-luc表达质粒构建成功,为研究DNA疫苗体内表达机制和体内电穿孔递送条件优化奠定了基础。     

甲型H1N1流感病毒血凝素HA1在糖基工程毕赤酵母中的表达

目的:建立用糖基工程酵母制备流感血凝素的方法 ,研究其免疫原性,为酵母表达流感疫苗提供基础。方法:通过PCR的方法扩增编码H1N1流感病毒血凝素HA1(1～330 aa)的基因片段,将HA1基因克隆到表达载体pPIC9质粒上,电转化到糖基工程酵母中,甲醇诱导表达并用镍亲和层析柱纯化重组蛋白,N-糖苷酶F(PNGF)酶切分析N-糖链,Western印迹验证纯化蛋白,免疫小鼠并测定HA1诱导抗体的滴度。结果:获得HA1基因的酵母重组表达菌株,SDS-PAGE分析可见野生型GS115表达的重组HA1相对分子质量约为100×103,而糖基工程酵母GJK01表达的HA1约为60×103,PNGF酶切后相对分子质量均降至45×103左右;经Western印迹检测,这些条带均为目的蛋白条带,野生型和糖基工程酵母表达的HA1分子大小不同是由于不同的N-糖基化修饰引起的。重组HA1免疫小鼠可产生抗HA1抗体,随着抗原剂量的增加,其产生的抗体滴度相应增加;3次免疫后,4μg HA1诱导小鼠产生的抗体滴度最高。结论:利用糖基工程酵母表达制备了低糖化的流感病毒血凝素HA1,该重组蛋白可以诱导小鼠产生HA1抗体,且产生的抗体滴度具有HA1剂量依赖性。     

骨形成蛋白-2表达载体的构建及其转录活性测定

将骨形成蛋白-2(BMP-2)基因克隆入带HA标签的BMP-2表达载体中,得到带HA标签的重组质粒pGBKT7/HA-BMP-2,将该重组质粒转染酵母AH109、Y187细胞,Western印迹检测表明表达了与预期相对分子质量大小一致的BMP-2.BMP-2表达载体的成功构建为深入研究骨形成蛋白-2在促进骨痂生成过程中的分子机制及其生物学功能打下了基础.     

人LC3B基因的真核表达及鉴定

目的:构建带HA标签的重组人LC3B基因的真核表达载体,获得HA-LC3B融合蛋白,并初步检测其生物学功能。方法:从人乳腺文库中通过PCR技术扩增LC3B基因编码序列,将其插入pc DNA3.0-HA载体,获得HA-LC3B真核表达载体;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测转染细胞的表达情况,免疫共沉淀实验证实其生物学活性。结果:双酶切和测序结果表明HA-LC3B真核表达质粒构建成功,Western印迹表明重组质粒转染293T细胞后获得表达;免疫共沉淀实验显示HA-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白相互作用,具有较好的生物学活性。结论:在真核表达系统中表达了带HA标签的人LC3B,为进一步研究细胞自噬奠定了基础。     

以减毒沙门氏菌运送的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的构建及其对小鼠的免疫原性

根据GenBank中已发表的H5亚型禽流感病毒HA基因序列,设计一对引物,通过RTPCR扩增鹅源H5亚型高致病力禽流感病毒HA基因,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1和asdpVAX1得到重组表达载体pVAX1HA和asdpVAX1HA。将重组质粒转染P815细胞,经间接免疫荧光试验证实,HA基因在细胞内得到了瞬时表达。进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550得到两种运送DNA疫苗的重组沙门氏菌X4550（pVAX1HA）和X4550（asdpVAX1HA）,以1×109CFU/只的剂量两次口服免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠不仅可以检测到HA特异性的血清抗体应答,而且还能抵抗稳定表达H5亚型禽流感病毒HA基因的P815肥大细胞瘤的攻击,说明该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒,并且能够刺激机体产生保护性免疫应答。     

杆状病毒AcMNPV p48基因在昆虫细胞中的表达

【目的】p48(ac103)基因在昆虫杆状病毒中高度保守,暗示其具有重要的生物学功能。为了研究该基因的功能,我们首先对该基因的表达特征进行描述。【方法】以杆状病毒代表种——苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的p48基因为研究对象,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统分别构建了在P48蛋白N-端和C-端融合HA-标签,并且携带绿色荧光蛋白基因和多角体蛋白基因的重组Bacmid。将重组Bacmid转染Sf9细胞,收集含病毒的上清去感染Sf9细胞,在感染后不同时间点收集细胞进行SDS-PAGE电泳,利用商业化的HA抗体进行Western blot分析以检测融合蛋白在昆虫细胞中的表达情况。【结果】用C-端融合HA-标签的重组病毒感染细胞后12h即可检测到一条43kDa左右、能与HA抗体发生特异性结合的蛋白条带,该特异性蛋白的表达一直持续到病毒感染后96h。从感染后48h起一直到96h,均能检测到另外一条约26kDa的蛋白条带也能与HA抗体发生特异性结合。在N-端融合HA-标签的重组病毒感染的细胞中没有检测到与HA抗体特异结合的蛋白。【结论】结果表明,p48基因是个晚期基因,在病毒感染的晚期表达,并且该蛋白在昆虫细胞中表达时N-端可能被剪切。     

草鱼重组瘦蛋白的制备及其对JAK2-STAT3信号通路的作用研究

瘦素(leptin)是主要由脂肪细胞分泌的蛋白质,具有调节机体食物摄入和能量代谢的功能。为了获得具有生物活性的瘦蛋白,本研究采用PCR技术从草鱼脑垂体中扩增出瘦素的cDNA开放阅读框(open reading frame, ORF)序列,用于构建pGEX4T-1-CiLEP重组质粒(带GST标签),并将重组质粒在大肠杆菌BL21中进行原核表达。经SDS-PAGE和Western-blot检测证实,在47 kD处有与预期相对分子质量相符的融合重组瘦蛋白(即含GST标签的草鱼重组瘦蛋白)。体内注射试验结果表明,与注射GST标签蛋白相比,纯化后的融合重组瘦蛋白的注射对草鱼脑垂体和肠道的瘦素受体基因及JAK2-STAT3信号通路相关基因的表达有上调作用。以上结果为进一步研究草鱼重组瘦蛋白对JAK2-STAT3信号通路相关基因表达的影响和深入了解草鱼瘦素基因的功能及其调控机制奠定了基础。     

Nono蛋白的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的表达和纯化带多聚组氨酸（6×His）标签的Nono （ non-POU-domain-containing, octamer-binding protein ）融合蛋白并制备抗Nono多克隆抗体。方法构建pET-28a（＋）-Nono重组表达质粒,转入Rosetta（DE3）大肠埃希菌,以IPTG诱导6×His-Nono融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫BALB／C小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-Nono融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫小鼠,获得了高特异性的抗Nono抗血清。结论成功构建pET-28a（＋）-Nono原核表达质粒,表达并纯化出高纯度的目标蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体。     

甘丙肽2型受体在HEK293A细胞中的同源二聚化研究

G蛋白偶联受体二聚化在受体的转运和信号转导中起着重要的调节作用.为了验证甘丙肽2型受体(GalR2)是否形成同源二聚体,本实验分别构建了N端带FLAG和HA标签的GalR2融合蛋白,并转染到HEK293A细胞中.Western blot发现,除了相当于GalR2分子量的位置有条带之外,在大约2倍于GalR2分子量的位置...     

利用DNA免疫技术制备果蝇GBB多克隆抗体及其表达模式的分析

TGF-β信号家族在生物体生命活动中具有多种发育和生理功能。研究该信号家族在生物体内的表达模式具有重要的意义。gbb是TGF-β信号成员bmp7的果蝇同源基因,为了进一步研究gbb对胚胎发育的影响,本文采用DNA免疫技术制备得到果蝇GBB多克隆抗体。首先提取果蝇总RNA,反转录得到cDNA文库,以该文库为模板克隆出gbb基因编码区序列,构建成真核表达质粒pCAGGS-P7/gbb。采用DNA免疫技术免疫BALB/c小鼠,取心血分离血清制备了GBB多克隆抗体。免疫印迹试验表明制备的GBB多克隆抗体有效,果蝇胚胎免疫荧光分析表明GBB在果蝇胚胎发育0～9 h无明显表达,9 h之后开始高效表达。     

DEK蛋白的真核表达纯化及其活性检测

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达DEK蛋白并进行纯化。首先以pFastBacI质粒构建重组质粒pFastBacI-DEK,转化DH10Bac大肠杆菌后获得重组穿梭载体Bacmid-DEK,通过脂质体介导转染Sf9细胞产生具有强感染力的重组杆状病毒AcNPV-DEK。用此重组杆状病毒AcNPV-DEK感染Sf9细胞表达His-DEK融合蛋白。在非变性条件下,利用Ni-NTA agarose对表达的His-DEK融合蛋白进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting分析,在50 kDa处出现特异性蛋白条带并证实其为His-DEK融合蛋白。凝胶迁移阻滞实验表明,融合蛋白His-DEK与DNA 的结合具有结构特异性,其与超螺旋型DNA结合活性强于与线性化DNA的结合活性。真核表达并纯化的融合蛋白His-DEK与DNA的结合活性要明显强于原核表达的融合蛋白His-CDB。DEK 蛋白的磷酸化修饰会阻碍其与DNA的结合,而Sf9细胞中表达的融合蛋白His-DEK存在磷酸化修饰,将His-DEK去磷酸化后,其与DNA的结合活性有所提高。     

铁蛋白重链亚铁氧化酶活性突变体的构建及鉴定

[目的]构建小鼠铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH)亚铁氧化酶活性突变基因的真核表达载体。[方法]针对小鼠FTH基因的亚铁氧化酶活性关键位点(K86、E62和H65),设计并合成6条PCR引物。利用重叠延伸PCR技术,获得小鼠FTH基因的突变体m FTH(K86Q、E62K和H65G),简写为m FTH(3M)。然后将m FTH(3M)插入到实验室已有的C端带Flag标签的真核表达载体pc DNA3中,插入位置为多克隆位点区域中限制性内切酶Bam HⅠ和HindⅢ之间,从而得到亚铁氧化酶活性缺失的FTH真核表达载体pc DNA3-m FTH(3M)-Flag。重组质粒经酶切和测序鉴定正确后,用脂质体lipofectamineTM2000将其转染到RAW264.7细胞中,检测细胞中带有Flag标签的m FTH(3M)蛋白的表达。[结果]重组质粒酶切得到预期片段,测序显示所构建的m FTH(3M)真核表达载体序列正确,细胞内检测到带Flag标签的m FTH(3M)蛋白信号的强烈表达。[结论]实验成功构建了小鼠FTH亚铁氧化酶活性位点基因突变的真核表达载体pc DNA3-m FTH(3M)-Flag。     

CH50真核表达载体pCH503的构建及小鼠体内表达的趋化与抗肿瘤活性

构建重组 FN多肽 CH50真核表达载体并在小鼠体内表达 ,研究其趋化与抗肿瘤作用 .采用重组 DNA技术构建表达质粒 ;体内进行基因转染 ,采用 RT- PCR鉴定导入基因的表达 ;通过肝素亲和层析、SDS- PAGE和 Western blot鉴定表达产物 ;腹腔细胞计数、Giemsa染色分析以及肌肉组织切片与染色观察体内基因转染后的趋化作用 ;小鼠黑色素瘤模型研究基因转染抑制肿瘤的作用 .从 CH50原核表达载体获得重组多肽的 c DNA,5′端加上小鼠 IFN- 5′端非编码区和信号肽编码区的 c DNA,3′端加上人 FN c DNA的 3′端非编码区 ;将重组 c DNA插入 p REP8质粒 ,即构建出p CH50 3质粒 .巨噬细胞在体内经 p CH50 3转染 ,然后在体外培养 ,能够产生 CH50多肽 .以p CH50 3分别进行腹腔基因转染和肌肉内基因转染 ,均可对免疫细胞产生趋化作用 ;p CH50 3体内转染可以使小鼠腹腔内黑色素肿瘤结节数降低 50 %～ 60 % . CH50真核表达载体 p CH50 3可在小鼠体内表达 ,体内基因转染可趋化免疫细胞和抑制肿瘤结节形成 ,在肿瘤综合治疗中有重要意义 .     

CH50真核表达载体pCH503的构建及小鼠体内表达的趋化与抗肿瘤活性

构建重组 FN多肽 CH50真核表达载体并在小鼠体内表达 ,研究其趋化与抗肿瘤作用 .采用重组 DNA技术构建表达质粒 ;体内进行基因转染 ,采用 RT- PCR鉴定导入基因的表达 ;通过肝素亲和层析、SDS- PAGE和 Western blot鉴定表达产物 ;腹腔细胞计数、Giemsa染色分析以及肌肉组织切片与染色观察体内基因转染后的趋化作用 ;小鼠黑色素瘤模型研究基因转染抑制肿瘤的作用 .从 CH50原核表达载体获得重组多肽的 c DNA,5′端加上小鼠 IFN- 5′端非编码区和信号肽编码区的 c DNA,3′端加上人 FN c DNA的 3′端非编码区 ;将重组 c DNA插入 p REP8质粒 ,即构建出p CH50 3质粒 .巨噬细胞在体内经 p CH50 3转染 ,然后在体外培养 ,能够产生 CH50多肽 .以p CH50 3分别进行腹腔基因转染和肌肉内基因转染 ,均可对免疫细胞产生趋化作用 ;p CH50 3体内转染可以使小鼠腹腔内黑色素肿瘤结节数降低 50 %～ 60 % . CH50真核表达载体 p CH50 3可在小鼠体内表达 ,体内基因转染可趋化免疫细胞和抑制肿瘤结节形成 ,在肿瘤综合治疗中有重要意义 .     

小鼠大脑抑制性神经元特异性多聚核糖体结合型mRNA的提取

目的:建立能够高效、快速地从小鼠大脑提取抑制性神经元特异性多聚核糖体结合的mRNA的方法,为进行小鼠大脑抑制性神经元特异性翻译表达谱分析提供材料。方法:依据Cre-loxp系统,将RiboHA标签小鼠与抑制性神经元特异性VGAT-Cre/PV-Cre小鼠杂交,启动抑制性神经元中核糖体上HA标签的表达。后代小鼠进行基因型鉴定,获得同时表达Cre和HA的小鼠。利用免疫荧光染色检测HA的表达。通过免疫共沉淀从目标细胞群体中获得HA标记的多聚核糖体。提取多聚核糖体结合的mRNA。荧光定量PCR法检测所得mRNA的细胞类型特异性。利用琼脂糖凝胶电泳及bioanalyzer 2100检测所得mRNA及cDNA的质量。结果:HA标记的多聚核糖体在目标细胞群体中能够被高效启动表达。抑制性神经元特异性多聚核糖体结合的mRNA能够被特异性地富集提取。所获细胞类型特异性的多聚核糖体结合的mRNA及cDNA的质量足以用来进行高通量测序及翻译表达谱的分析。结论:利用Cre-loxp遗传系统标记,结合蛋白免疫共沉淀实验,建立了从小鼠大脑抑制性神经元中高效特异地获得多聚核糖体结合的mRNA的方法,为进一步进行小鼠大脑抑制性神经元特异性翻译表达谱的分析奠定了基础。     

小鼠DLL1真核表达载体的构建及其在肿瘤细胞中的表达

目的：构建带绿色荧光蛋白的小鼠DLL1全长基因真核表达载体,并在肿瘤细胞中表达。方法：利用PCR特异性引物扩增出DLL1基因全长,将克隆的基因片段插入带绿色荧光蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP质粒中。然后利用脂质体将重组质粒pIRES2-EGFP-DLL1转染进小鼠B16黑色素瘤细胞中,并通过G418筛选后选取生长良好、荧光强度高的三株单克隆进行mRNA水平DLL1表达的鉴定。结果：成功扩增小鼠DLL1的全长基因。克隆入质粒载体后,通过DNA序列测定证实其序列正确。将构建的pIRES2-EGFP-DLL1质粒转染小鼠B16黑色素瘤细胞,经过G418筛选和荧光显微镜观察后,挑选得到GFP阳性率90%以上的稳定转染细胞株。RT-PCR检测稳定转染细胞的mDLL1的表达显著增加,进一步证实了pIRES2-EGFP-DLL1的表达效能。结论：成功构建了小鼠DLL1基因的真核表达质粒,证实其在真核细胞B16中可以表达。