家蝇抗菌肽基因MAF-1的表达模式及响应微生物刺激分析

Musca domestica antifungal peptide-1(MAF-1)是家蝇体(Musca domestica)内组成型表达的一种独特且具有良好抑菌效果的抗真菌肽.本研究利用实时荧光定量PCR技术分析MAF-1在家蝇不同发育时期、不同组织器官及家蝇3龄幼虫经微生物(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌)刺激后的表达特征.结果显示,MAF-1在家蝇各个发育时期的相对表达量依次为:2龄幼虫＞1龄幼虫＞3龄幼虫＞雄蝇成虫＞卵＞雌蝇成虫＞蛹;MAF-1在家蝇3龄幼虫各组织器官的相对表达量依次为:脂肪体＞唾液腺＞气管＞肠道＞体壁.通过超微量显微注射法向家蝇3龄幼虫体内注入病原微生物,其中金黄色葡萄球菌刺激后MAF-1的表达量呈下降趋势;大肠杆菌刺激后MAF-1的表达量先降低后升高再降低;白色念珠菌刺激后MAF-1的表达量先升高然后逐渐下降.本研究从RNA水平上说明了MAF-1的表达随着家蝇幼虫的生长发育阶段变化,对不同微生物刺激的响应具有不同的特征.同时MAF-1还是家蝇抵抗病原微生物感染的重要天然免疫分子,这为进一步研究其参与家蝇天然免疫防御过程提供了基础.     

家蝇抗菌肽基因MAF-1的表达模式及响应微生物刺激分析

Musca domestica antifungal peptide-1(MAF-1)是家蝇体(Musca domestica)内组成型表达的一种独特且具有良好抑菌效果的抗真菌肽.本研究利用实时荧光定量PCR技术分析MAF-1在家蝇不同发育时期、不同组织器官及家蝇3龄幼虫经微生物(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌)刺激后的表达特征.结果显示,MAF-1在家蝇各个发育时期的相对表达量依次为:2龄幼虫＞1龄幼虫＞3龄幼虫＞雄蝇成虫＞卵＞雌蝇成虫＞蛹;MAF-1在家蝇3龄幼虫各组织器官的相对表达量依次为:脂肪体＞唾液腺＞气管＞肠道＞体壁.通过超微量显微注射法向家蝇3龄幼虫体内注入病原微生物,其中金黄色葡萄球菌刺激后MAF-1的表达量呈下降趋势;大肠杆菌刺激后MAF-1的表达量先降低后升高再降低;白色念珠菌刺激后MAF-1的表达量先升高然后逐渐下降.本研究从RNA水平上说明了MAF-1的表达随着家蝇幼虫的生长发育阶段变化,对不同微生物刺激的响应具有不同的特征.同时MAF-1还是家蝇抵抗病原微生物感染的重要天然免疫分子,这为进一步研究其参与家蝇天然免疫防御过程提供了基础.     

家蝇Mdsirt1基因在细菌、高温和重金属胁迫下的表达分析

【目的】探究家蝇Musca domestica sirt1基因(Mdsirt1)在各种胁迫条件下的表达模式。【方法】以家蝇2龄幼虫cDNA为模板,PCR扩增Mdsirt1基因序列并进行生物信息学分析;实时定量PCR(qRT-PCR)检测Mdsirt1在家蝇不同发育阶段(卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹和成虫)的表达变化,2龄幼虫不同组织(表皮、肠道、脂肪体和血细胞)中的表达分布,以及胁迫条件(细菌刺激、热激及CdCl_2刺激)下的转录水平变化;通过RNAi干扰Mdsirt1基因表达,观察敲低Mdsirt1表达后家蝇幼虫抗病能力变化,并检测机体氧化应激水平。【结果】家蝇Mdsirt1基因编码蛋白含有SIR2结构域,与厩螫蝇Stomoxys calcitrans SIR2氨基酸序列一致性为66%。qRT-PCR结果显示,Mdsirt1基因主要在家蝇蛹期表达,在家蝇2龄幼虫脂肪体中表达量较高。家蝇幼虫Mdsirt1分别在大肠杆菌Escherichia coli刺激3 h,金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus刺激6 h,42℃热激30min以及30 mmol/L CdCl_2刺激48 h时表达量达到最高峰。敲低Mdsirt1表达的家蝇幼虫受到细菌感染(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌1∶1混合感染)后存活率较对照组显著降低1.47倍,且敲低Mdsirt1后机体处于氧化应激状态,活性氧自由基水平和丙二醛含量较对照组分别升高1.58和1.59倍。【结论】Mdsirt1参与家蝇幼虫的抗菌免疫应答和抗逆反应。     

家蝇肽聚糖识别蛋白(PGRP-SA)的克隆表达及细菌结合研究

对家蝇PGRP-SA基因进行克隆表达以及研究其重组蛋白与细菌结合能力。从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫cDNA质粒文库中筛选到PGRP-SA基因,以cDNA质粒为模板设计引物,通过PCR扩增,获得PGRP-SA基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。构建pET-28a(+)-PGRP-SA重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达及蛋白纯化。利用半定量RT-PCR检测PGRP-SA在家蝇3龄幼虫不同组织中的表达量差异。PGRP-SA重组蛋白进行微生物结合实验。结果表明,PGRP-SA基因ORF全长615 bp,编码204个氨基酸,理论分子量22.8 k D,等电点9.11,具有保守的PGRP结构域。成功构建了pET-28a(+)-PGRP-SA重组质粒,蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,利用Western blot检测证明纯化蛋白与预期大小相符。PGRP-SA在家蝇3龄幼虫血淋巴、脂肪体、前肠、中肠、气管、马氏管都有表达,血淋巴组织中表达量最高,后肠无表达,由此说明PGRP-SA基因的表达具有一定的组织性。PGRP-SA重组蛋白能与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌结合,与白色念珠菌不能结合。成功表达及纯化家蝇PGRP-SA蛋白,证实家蝇PGRP-SA能与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌结合。     

家蝇C-型凝集素的克隆与功能分析

【目的】从家蝇Musca domestica中克隆一种C-型凝集素(C-type lectin)基因,并分析其在家蝇免疫过程中的功能。【方法】根据家蝇转录组信息,克隆了一条C型凝集素基因,将其命名为Mdlectin-C1。构建Mdlectin-C1的原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中表达并纯化r Mdlectin-C1蛋白,制备多克隆抗体。利用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)及Western blot技术对家蝇不同发育阶段和细菌感染前后Mdlectin-C1的表达水平进行检测。运用RNAi技术敲低家蝇1龄幼虫Mdlectin-C1基因表达,然后进行细菌刺激并观察幼虫存活率变化。【结果】Mdlectin-C1 c DNA包含一个546 bp完整开放阅读框,编码181个氨基酸残基,所推导多肽N端包含由21个氨基酸残基组成的信号肽,成熟肽中含有一个保守的碳水化合物识别结构域(carbohydrate-recognition domain,CRD)。qRT-PCR及Western blot结果显示,家蝇从1龄幼虫到蛹的发育过程中,Mdlectin-C1表达量逐步上升,蛹期达到最大值。在革兰氏阴性菌大肠杆菌E.coli和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus刺激后,家蝇2龄幼虫Mdlectin-C1均上调表达,并分别在36和3 h时达到最高值。利用RNAi技术成功敲低Mdlectin-C1表达。对Mdlectin-C1基因敲低的1龄幼虫进行细菌刺激,敲低实验组幼虫存活率显著低于正常对照组。【结论】Mdlectin-C1可能参与家蝇抗菌免疫应答,并在此过程中具有重要作用。     

家蝇溶菌酶2基因的克隆及其性质研究

溶菌酶(lysozyme)作为抗菌肽重要一员,在昆虫先天免疫系统中起着重要作用.本文通过家蝇EST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇Musca domestica的lysozyme 2基因(Md-lysozyme 2,MdL2)全长516 bp的cDNA序列.MdL2包含429 bp的开放阅读框,编码142个氨基酸残基,推导的氨基酸序列N端包括加个氨基酸残基的信号肽,成熟肽由122个氨基酸残基组成,理论分子量为13.89 kD,理论等电点为6.45,有8个半胱氨酸组成4对分子内二硫键.实时荧光定量PCR结果显示大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别刺激后,家蝇幼虫体内MdL2基因的表达模式发生了非常相似的变化.在刺激3～12 h表达下调,12～24 h出现一个短暂的恢复,在刺激24 h后表达又开始下调.不同组织定量PCR结果表明MdL2表达量在肠和血细胞中较高,而在表皮和脂肪体中较低.MdL2成熟肽编码序列被克隆人pET-DsbA表达载体,并转化大肠杆菌后得到高效表达.     

不同诱导条件下家蝇(Musca domestica)三龄幼虫免疫相关基因的表达研究

旨在研究在不同诱导条件下家蝇三龄幼虫先天性免疫基因的表达情况。采用冷刺激、热刺激及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌注射诱导12 h后提取家蝇三龄幼虫总RNA。根据GenBank公布的家蝇磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因、攻击素(Attacin)、天蚕素(Cecropin)、防御素(Defensin)、双翅肽(Diptericin)、溶菌酶(Lysozyme)、热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)及家蝇抗真菌肽(MAF-1)基因序列进行RT-PCR反应,以GAPDH基因为内参照,分析在不同诱导条件下家蝇三龄幼虫先天性免疫基因的表达情况。结果显示,不同条件诱导下,家蝇免疫相关基因表达显现较大差异,微生物诱导比物理刺激诱导后家蝇免疫相关基因表达水平高;真菌、阳性菌诱导后家蝇免疫相关基因表达量最高,阴性菌次之;冷刺激诱导最低。微生物及物理刺激均能激活家蝇的免疫系统,在不同条件刺激下,家蝇幼虫机体免疫应激反应不同。     

家蝇Phormicin A多克隆抗体的制备及效价检测

家蝇Phormicin作为防御素家族的成员,是一类具有广普抗菌活性的抗菌肽.本研究采用原核表达法表达并纯化获得了家蝇PhormicinA蛋白.将家蝇Phormicin A原核表达蛋白与完全佐剂和不完全佐剂乳化混匀,先后免疫新西兰白兔获得其多克隆抗体.通过原核表达蛋白中和吸附实验,以及Western blot实验验证了抗体的特异性.进一步用金黄色葡萄球菌刺激家蝇三龄幼虫样品,进行内源性验证并测定抗体的效价.结果 显示,该多克隆抗体既可以识别家蝇Phormicin A原核表达蛋白,也可以识别金黄色葡萄球菌刺激家蝇三龄幼虫产生的内源性Phormicin A蛋白.本研究为进一步探索Phormicin在家蝇天然免疫和防御中的机制等后续工作打下基础.     

家蝇幼虫消减文库的构建及差异表达基因的鉴定

为了鉴定家蝇Musca domestica免疫相关基因,应用抑制性消减杂交技术,构建刺激家蝇幼虫差异表达cDNA消减文库。以大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus诱导12 h的家蝇幼虫与未诱导的家蝇幼虫为消减杂交对象,获得了差异表达基因的cDNA片段,将其与T/A载体连接并转化大肠杆菌DH5α,构建了刺激家蝇幼虫cDNA消减文库。PCR检测发现,文库的阳性克隆中插入的cDNA片段大小在200~1 000 bp之间,随机挑选了161个含大小不等差异片段的克隆进行测序和同源性分析,鉴定了36种蛋白的基因片段,包括抗菌肽、酶、核糖体蛋白、其他功能蛋白以及功能不明的蛋白。用半定量RT-PCR分析了其中6种蛋白基因的表达,结果显示：防御素和攻击素基因在细菌刺激后24 h内明显上调表达,而溶菌酶、酚氧化酶原活化因子、糜蛋白酶和蛋白质合成起始因子基因在细菌刺激后0-4 h内表达受抑制,12 h后上调表达。该研究结果为家蝇免疫相关基因的克隆和家蝇免疫防御机制的探讨奠定了良好的基础。     

家蝇几丁质酶基因MDCII重组表达质粒的构建及表达模式研究

从家蝇EST测序数据库中筛选获得家蝇几丁质酶基因MDCII,对该基因进行克隆及分子特性分析,探讨其在家蝇不同组织、不同发育时期及经不同微生物诱导后的时空表达模式。利用EST测序技术从已构建的家蝇幼虫c DNA质粒文库筛选出MDCII基因,运用生物信息学方法分析该基因序列及其编码蛋白的理化特性,采用邻接法构建系统进化树;PCR技术扩增目的基因,构建p EASY-E1-MDCII重组质粒,转化到Trans1-T1克隆感受态细胞中;采用实时荧光定量PCR(Real Time PCR)技术,检测MDCII基因在不同发育时期和不同组织部位的表达差异;采用注射法将不同微生物导入到家蝇3龄幼虫体内,Real Time PCR检测诱导后不同时间点MDCII基因表达水平的变化。结果显示,MDCII基因的ORF框全长1 374 bp,编码457个氨基酸,理论分子量51.6 k D,进化树分析比对与果蝇成虫盘生长因子的遗传距离较近。构建了具有正确基因序列的p EASY-E1-MDCII重组质粒。MDCII基因在家蝇不同发育阶段中均有不同程度的表达,在3龄幼虫中,以唾液腺和脂肪体中的表达水平较高;在白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌诱导后3 h,MDCII基因均出现明显的表达上调。MDCII基因属于几丁质酶中成虫盘生长因子,参与了家蝇的生长发育,在免疫防御过程中也发挥了一定作用。