家蝇抗菌肽基因MAF-1的表达模式及响应微生物刺激分析

Musca domestica antifungal peptide-1(MAF-1)是家蝇体(Musca domestica)内组成型表达的一种独特且具有良好抑菌效果的抗真菌肽.本研究利用实时荧光定量PCR技术分析MAF-1在家蝇不同发育时期、不同组织器官及家蝇3龄幼虫经微生物(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌)刺激后的表达特征.结果显示,MAF-1在家蝇各个发育时期的相对表达量依次为:2龄幼虫＞1龄幼虫＞3龄幼虫＞雄蝇成虫＞卵＞雌蝇成虫＞蛹;MAF-1在家蝇3龄幼虫各组织器官的相对表达量依次为:脂肪体＞唾液腺＞气管＞肠道＞体壁.通过超微量显微注射法向家蝇3龄幼虫体内注入病原微生物,其中金黄色葡萄球菌刺激后MAF-1的表达量呈下降趋势;大肠杆菌刺激后MAF-1的表达量先降低后升高再降低;白色念珠菌刺激后MAF-1的表达量先升高然后逐渐下降.本研究从RNA水平上说明了MAF-1的表达随着家蝇幼虫的生长发育阶段变化,对不同微生物刺激的响应具有不同的特征.同时MAF-1还是家蝇抵抗病原微生物感染的重要天然免疫分子,这为进一步研究其参与家蝇天然免疫防御过程提供了基础.     

家蝇抗菌肽基因MAF-1的表达模式及响应微生物刺激分析

Musca domestica antifungal peptide-1(MAF-1)是家蝇体(Musca domestica)内组成型表达的一种独特且具有良好抑菌效果的抗真菌肽.本研究利用实时荧光定量PCR技术分析MAF-1在家蝇不同发育时期、不同组织器官及家蝇3龄幼虫经微生物(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌)刺激后的表达特征.结果显示,MAF-1在家蝇各个发育时期的相对表达量依次为:2龄幼虫＞1龄幼虫＞3龄幼虫＞雄蝇成虫＞卵＞雌蝇成虫＞蛹;MAF-1在家蝇3龄幼虫各组织器官的相对表达量依次为:脂肪体＞唾液腺＞气管＞肠道＞体壁.通过超微量显微注射法向家蝇3龄幼虫体内注入病原微生物,其中金黄色葡萄球菌刺激后MAF-1的表达量呈下降趋势;大肠杆菌刺激后MAF-1的表达量先降低后升高再降低;白色念珠菌刺激后MAF-1的表达量先升高然后逐渐下降.本研究从RNA水平上说明了MAF-1的表达随着家蝇幼虫的生长发育阶段变化,对不同微生物刺激的响应具有不同的特征.同时MAF-1还是家蝇抵抗病原微生物感染的重要天然免疫分子,这为进一步研究其参与家蝇天然免疫防御过程提供了基础.     

家蝇抗菌肽Cecropin-His_6融合基因的克隆、序列分析及其表达载体构建

克隆家蝇幼虫抗菌肽Cecropin -His 6融合基因 ,构建其真核表达载体 ,为更深入的抗菌肽活性研究及制备新型肽类抗生素创造条件。该文从家蝇幼虫组织中提取总RNA ,RT -PCR扩增编码Cecropin开放阅读框cDNA序列 ,将其克隆至pUCm -T载体进行序列测定 ;然后用含 6×His标签序列的下游引物克隆Cecropin -His 6融合基因 ,并将其构建于真核表达载体pcDNA3.1( )中 ;同时应用生物信息学对融合基因的理化性质和二级结构进行预测分析。结果表明 ,RT -PCR扩增得到约 2 30bp的目的cDNA片段 ,与Genebank中报道的家蝇CecropincDNA序列存在一个无义变异差异 (Lys:AAG→AAA) ;6×His标签成功融合到Cecropin的C端。Cecropin -His 6融合基因的克隆和真核表达载体的成功构建 ,为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础。     

家蝇幼虫抗菌肽Attacin基因的克隆表达及抑菌生物学活性

目的克隆家蝇幼虫Attacin抗菌肽基因．构建原核融合表达载体,建立Attacin体内抗菌活性检测系统,优化表达和纯化Attacin目的蛋白,并初步研究其抗菌生物学功能。方法以pUC m-T／Attacin重组质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Attacin编码区序列,分别克隆至原核表达载体pET30a（＋）和pGEX-4T-1。构建原核重组质粒,转化大肠埃希菌,表达重组Attacin蛋白,并在大肠埃希菌中体内检测Attacin的抗菌活性。利用亲和层析柱纯化重组融合蛋白Attacin,SDS-PAGE进行纯度分析,琼脂糖平板抑菌试验鉴定其生物活性。结果pET30a（a＋）／Attacin和pGEX-4T—1／Attacin重组质粒分别转化大肠埃希菌后,以IPTG诱导表达,与未诱导对照相比,含有重组质粒的宿主菌生长受到抑制。从pET30a（＋）／Attacin重组质粒的表达宿主菌中未能获得His-Attacin融合蛋白,而从pGEX-4T—1／Attacin重组质粒转化菌种获得GST-Attacin融合蛋白。SDS-PAGE分析表明Attacin重组蛋白分子量与预期结果一致,琼脂糖平板抑菌试验显示重组Attacin具有抗菌活性。结论Attacin基因在原核系统中成功表达,并且纯化后具有抑菌活性,为下一步研究Attacin的生物学功能及其应用开发奠定了基础。     

家蝇幼虫血淋巴抗真菌肽MAF-1的分子特性分析及其抗真菌作用

制备家蝇Musca domestica幼虫血淋巴中的抗真菌肽, 对其分子特性及抗真菌机制进行研究。通过C₁₈柱固相萃取、 反相高效液相色谱相结合的方法, 成功制备到家蝇幼虫血淋巴抗真菌肽 MAF-1。SDS-PAGE分析结果表明, MAF-1的分子量为17.136 kDa。通过圆二色谱测出水溶液中MAF-1主要以α螺旋及β折叠为主。扫描电镜观察结果显示, MAF-1作用白假丝酵母菌Candida albicans 1 h后, 部分真菌出现表面凸凹不平, 细胞结构模糊; 随着作用时间的延长, 表面形成很明显的凹陷, 皱缩, 个别菌体破裂, 内容物外泄, 病变真菌发生率高于对照组。单细胞凝胶电泳（single-cell gel electrophoresis, SCGE）结果显示, 正常对照组的真菌呈现典型的圆形, 而实验组则出现明显的拖尾现象即形成“彗星”样细胞特征, 细胞迁移距离明显高于对照组。SDS-PAGE图谱显示, MAF-1作用后的白假丝酵母菌菌体蛋白谱带一些条带明显变浅, 条带数下降, 甚至消失。结果提示MAF-1可能具有独特的抗真菌机制。     

家蝇抗菌肽基因的表达模式研究

本研究曾报道过家蝇生长过程中的3个基因attacin, defensin, cecropin的转录体. 通过运用实时定量PCR定量分析家蝇不同发育阶段和诱导后不同时间点的三龄幼虫mRNA水平, 结果显示3个基因在三龄幼虫和成虫期转录水平较高. 同时分析发现, 在诱导后mRNA水平显著增加, 3个抗菌肽基因在敏感菌诱导后转录水平相对诱导前分别有cecropin 805倍、attacin 1009倍、defensin 2500倍的增强. 结果提示, 家蝇抗菌肽基因的转录在不同发育阶段和诱导后的不同时期是有差异的.     

基因芯片技术筛选家蝇抗菌肽相关基因

用生物学软件对GenBank中部分昆虫抗菌肽基因编码区保守域设计探针, 用直接点样法将探针点印在特制玻片上构建寡核苷酸(Oligonucleotide, oligo)探针微阵列; 提取诱导后24 h的家蝇三龄幼虫脂肪体总RNA, 逆转录成cDNA并标记上荧光标记物Cy3, 与构建的oligo探针微阵列杂交, 经洗片、扫描处理后进行数据分析。结果在两次重复实验中均检测到有效杂交信号的基因点有15个(不包括阳性对照基因), 为进一步发现其新基因提供了依据。     

家蝇新型抗菌肽Muscin的基因克隆、表达模式及抑菌活性

【目的】鉴定家蝇 Musca domestica (Linnaeus)中一种新型抗菌肽(Muscin)基因,并分析其功能。【方法】通过数字基因表达谱和生物信息学分析,在家蝇转录组中筛选得到一条抗菌肽基因,命名为 muscin。以实时荧光定量PCR技术研究该基因的组织分布以及用大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus混合细菌刺激后的表达量变化。并对合成肽Muscin进行抑菌活性检测及溶血率测定。【结果】muscin基因cDNA序列全长379 bp,包含完整的开放阅读框153 bp。推导Muscin多肽序列由50个氨基酸残基组成,N端含有由25个氨基酸残基组成的信号肽。成熟肽中富含疏水性氨基酸残基和带正电荷的氨基酸残基,理论等电点为9.39。基因定量结果显示 muscin 基因在血细胞和脂肪体中表达量最高。通过细菌刺激进行免疫诱导后,幼虫体内该基因的表达水平明显上调,并在6 h达到高峰。抑菌和溶血实验显示c-Muscin对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广谱抑菌活性,且溶血活性较低。【结论】Muscin是一种新型的广谱抗菌肽,可能参与家蝇抗菌免疫反应,且具有一定药物开发潜质。     

家蝇抗菌肽Attacin-2基因的克隆、序列分析和诱导表达

攻击素(attacin)作为昆虫抗菌肽之一, 在昆虫的先天免疫中起着重要作用。本研究通过家蝇Musca domestica EST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇的Attacin-2基因(Mdatta2) cDNA序列。其全长819 bp, 包含一个726 bp的完整开放阅读框(open reading frame, ORF), 以及42 bp的5′末端非翻译区(5′-UTR)和51 bp的3′末端非翻译区(3′-UTR), 编码241个氨基酸残基, 推导的多肽N端22个氨基酸残基为信号肽序列。同源性分析表明, 其氨基酸序列与嗜凤梨果蝇Drosophila ananassae的Attacin一致性最高(46%)。以邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建的系统关系表明, 家蝇的Attacin-2与其他双翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先, 属于Attain_C超家族。应用实时荧光定量PCR的方法研究家蝇幼虫在受到外源细菌刺激时Mdatta2基因的表达, 结果显示, 在大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus分别刺激后3 h和6 h, 家蝇幼虫Mdatta2表达量出现显著上调。Mdatta2基因在家蝇幼虫体内呈诱导型表达, 表达水平随诱导时间的不同而变化, 提示Mdatta2基因可能在家蝇免疫防御过程中起着重要作用。     

家蝇抗菌肽Diptericin基因的克隆与分析

Diptericin是抗菌肽家族中的一员, 在昆虫先天免疫系统中起着重要作用。本研究通过EST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇Musca domestica的Diptericin基因（Md-Diptericin, MdDpt）cDNA序列, GenBank登录号为FJ794602。其全长410 bp, 包含一个300 bp的完整开放阅读框（ORF）, 推导的氨基酸序列C端富含甘氨酸, N端富含脯氨酸, 同源性分析表明, 它与厩蝇Stomoxys calcitrans的Diptericin A mRNA相似性最高（identity=74%）。以邻接法（Neighbor-Joining, NJ）构建的系统关系表明, 家蝇Diptericin与其他双翅目昆虫的Diptericin起源于共同的祖先, 属于Attain_C超家族（Attacin_C superfamily）。基因定量分析表明, 大肠杆菌刺激后6～12 h, 家蝇幼体MdDpt表达出现明显上调。结果提示MdDpt基因在家蝇免疫防御过程中起着重要作用。     

WFS1在大鼠胰腺不同发育阶段的表达

目的:研究WFS1在胰腺发育不同阶段的表达和细胞定位.方法:运用Western Blot技术检测WFS1在大鼠胰腺发育不同阶段的蛋白表达水平;运用免疫荧光检测不同时期WFS1在胰腺的定位.结果:Western Blot结果显示WFSl的蛋白表达量胚胎后期高于新生期,成年期表达量上升;免疫荧光结果显示在不同发育时期WFS1与胰岛β细胞共表达.结论:WFS1在胚胎发育中后期的高表达可能与胰岛形成及功能完善有关,并且可能参与了胰岛重塑.     

Cloning and Molecular Characterization of HSL and Its Expression Pattern in HPG Axis and Testis during Different Stages in Bactrian Camel

Hormone-sensitive lipase (HSL) is a key enzyme in animal fat metabolism and is involved in the rate-limiting step of catalyzing the decomposition of fat and cholesterol. It also plays an important regulatory role in maintaining seminiferous epithelial structure, androgen synthesis and primordial germ cell differentiation. We previously reported that HSL is involved the synthesis of steroids in Bactrian camels, although it is unclear what role it plays in testicular development. The present study was conducted to characterize the biological function and expression pattern of the HSL gene in the hypothalamic pituitary gonadal (HPG) axis and the development of testis in Bactrian camels. We analyzed cloning of the cDNA sequence of the HSL gene of Bactrian camels by RT-PCR, as well as the structural features of HSL proteins, using bioinformatics software, such as ProtParam, TMHMM, Signal P 4.1, SOPMA and MEGA 7.0. We used qRT-PCR, Western blotting and immunofluorescence staining to clarify the expression pattern of HSL in the HPG axis and testis of two-week-old (2W), two-year-old (2Y), four-year-old (4Y) and six-year-old (6Y) Bactrian camels. According to sequence analysis, the coding sequence (CDS) region of the HSL gene is 648 bp in length and encodes 204 amino acids. According to bioinformatics analysis, the nucleotide and amino acid sequence of Bactrian camel HSL are most similar to those of Camelus pacos and Camelus dromedarius, with the lowest sequence similarity with Mus musculus. In adult Bactrian camel HPG axis tissues, both HSL mRNA and protein expression were significantly higher in the testis than in other tissues (hypothalamus, pituitary and pineal tissues) (p < 0.05). The expression of mRNA in the testis increased with age and was the highest in six-year-old testis (p < 0.01). The protein expression levels of HSL in 2Y and 6Y testis were clearly higher than in 2W and 4Y testis tissues (p < 0.01). Immunofluorescence results indicate that the HSL protein was mainly localized in the germ cells, Sertoli cells and Leydig cells from Bactrian camel testis, and strong positive signals were detected in epididymal epithelial cells, basal cells, spermatocytes and smooth muscle cells, with partially expression in hypothalamic glial cells, pituitary suspensory cells and pineal cells. According to the results of gene ontology (GO) analysis enrichment, HSL indirectly regulates the anabolism of steroid hormones through interactions with various targets. Therefore, we conclude that the HSL gene may be associated with the development and reproduction of Bactrian camels in different stages of maturity, and these results will contribute to further understanding of the regulatory mechanisms of HSL in Bactrian camel reproduction.     

Nesprin2在小鼠睾丸各级生精细胞中的表达及其原核表达与纯化

目的:研究Nesprin2在小鼠睾丸各级生精细胞中的表达变化,并对Nesprin2进行原核表达和纯化,为进一步研究该蛋白在精子发生中的作用奠定基础。方法:制备小鼠睾丸细胞涂片,用Nesprin2特异性抗体进行细胞免疫荧光染色,观察Nesprin2在各级生精细胞中的表达;应用RT-PCR技术扩增Nesprin2 C端包含KASH domain的编码85个氨基酸的目的片段,将PCR产物插入到PUCm-T载体中测序,将测序验证后的目的片段亚克隆至原核表达载体PGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。对GST-Nesprin2 C85融合蛋白进行纯化,Western blot进行验证。结果:免疫荧光检测结果发现,Nesprin2在小鼠睾丸各级生精细胞中均有表达,主要分布在核膜及其周围,在减数分裂过程中Nesprin2可能参与核膜重塑。构建了PGEX-4T-1-Nesprin2 C85重组质粒,经IPTG诱导后成功表达了GST-Nesprin2 C85融合蛋白。对GST-Nesprin2 C85融合蛋白进行纯化后,Western blot进行检测,结果发现,原核诱导表达的融合蛋白为GST-Nesprin2 C85融合蛋白。结论:Nesprin2在小鼠各级生精细胞中均有表达,在减数分裂过程中可能参与核膜的重塑。     

日本囊对虾Cathepsin B基因在不同卵巢发育时期的表达

采用实时定量PCR技术,以18SrRNA为内标基因,检测日本囊对虾Cathepsin B基因在mRNA水平不同卵巢发育时期的表达。结果显示,Cathepsin B在卵黄合成前期表达最高,内源性卵黄合成期和外源性卵黄合成期表达水平基本一致,而在成熟期表达水平急剧下降。其中卵黄合成前期与其它3期相比具有显著性差异(P0.05),内源性卵黄合成期和外源性卵黄合成期Cathepsin B不具有显著性差异(P0.05),而成熟期与前边三期相比具有显著性差异(P0.05)。推测Cathepsin B可能在日本囊对虾卵巢发育中发挥了作用。     

辣椒ATP硫酸化酶基因（CaATPS1）的克隆与逆境表达

采用 RT-PCR和RACE方法,克隆了叶绿体ATP硫酸化酶基因的全长序列,命名为CaATPS1,GenBank 登录号为KX009745。该基因包含1个长为1 377 bp的完整开放阅读框,编码 458个氨基酸,预测分子量51.11 kD,等电点6.74。氨基酸同源性分析表明,该基因与 GenBank 中登录的茄科植物烟草、马铃薯及其它物种中的ATPS1氨基酸序列具有较高的同源性;进化树分析表明,辣椒CaATPS1与同为茄科属的烟草、马铃薯和胡麻属的芝麻处于同一进化分枝上,而与十字花科植物进化关系较远;荧光定量PCR分析显示,CaATPS1能被低温、干旱、高盐、机械损伤、过氧化氢、水杨酸、乙烯利以及DC3000侵染等各种胁迫和信号分子诱导。